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聚羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHAs)是微生物体内合成的一类生物聚酯,其不仅具有与传统合成塑料相似的材料性质,还具有生物可降解性、生物相容性、压电性等特性,具有广泛的应用前景。其中羟基丁酸和羟基戊酸共聚物(Poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate),PHBV)具有更优的性能,因而成为研究热点。本文以乙酰丙酸为原料,对真养产碱杆菌合成PHBV的发酵工艺进行优化,以提高PHBV的产量。
本文考察了不同营养成分对真养产碱杆菌利用乙酰丙酸合成羟基丁酸和羟基戊酸共聚物的影响。以乙酰丙酸为单一碳源,菌体生长被抑制,最大菌体干重仅为1.38 g/L,添加葡萄糖为辅助碳源,可以在保证菌体生长的基础上,得到羟基丁酸和羟基戊酸共聚物。确定了真养产碱杆菌利用乙酰丙酸合成羟基丁酸和羟基戊酸共聚物的最佳培养基组成为:葡萄糖25 g/L,乙酰丙酸4 g/L,酪蛋白胨2.0 g/L,Na2HPO4·12H2O3.0 g/L,NH4Cl0.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·H2O0.1 g/L,微量元素液10 m/L。微量元素液组成为:ZnSO4·7HEO10 mg/L,MnCl2·4H2O3 mg/L,H3BO330 mg/L,COCl2·6H2O20 mg/L,CuCl2·6H2O1 mg/L,NiCl2·6H2O2 mg/L,NaMoO4·2H2O3 mg/L。最适初始pH为7,最佳接种量为5％。此条件下,菌体干重达到5.75 g/L,PHBV产量达到3.83 g/L。
将上述所得培养基在2 L发酵罐中进行放大,恒转速分批培养获得的最大菌体干重和PHBV产量分别为6.00 g/L和3.47 g/L。将发酵液的溶氧控制在30％以上,获得的最大菌体干重为7.69 g/L,较恒转速分批培养提高了28.2％,但是最大PHBV产量只有2.86 g/L,比恒转速分批发酵降低了17.6％。用乙酰丙酸将发酵液的pH控制在7,获得的最大菌体干重和PHBV产量分别达到13.41 g/L和11.08 g/L,比恒转速分批培养分别提高了123.5％和219.3％。控制pH的条件下,将初始葡萄糖浓度降为10 g/L,并在发酵开始36 h后补加20 g/L葡萄糖,获得的最大菌体干重和PHBV产量分别达到16.43 g/L和12.45 g/L,比恒转速分批培养分别提高了173.8％和258.8％。控制溶氧和pH可以获得与补加葡萄糖相近的效果,最大菌体干重可以达到15.53 g/L,最大PHBV产量为12.61 g/L,占菌体干重的81.2％,PHBV中羟基戊酸单体的百分含量为54.0％。
初步考察了“两步法”培养真养产碱杆菌合成PHBV的条件。发现采用“两步法”,真养产碱杆菌利用单一乙酰丙酸的能力有所改善,但是PHBV产量仍只有0.63 g/L。添加40 g/L的葡萄糖作为辅助碳源,随着培养基中乙酰丙酸浓度的变化,可以获得羟基戊酸单体含量从0到41.4％的PHBV样品。对提取的PHBV样品进行初步表征,核磁共振定性分析结果表明,提取的PHBV样品与标准品的结构基本一致。热重分析结果表明,不同组成的PHBV样品具有比较接近的热分解性质,起始分解温度约为200℃,温度达到275℃以上都完全分解。