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研究背景目前认为,通过上调肺泡上皮钠离子通道(ENaC)的表达可以增加Na+的转运,为肺泡液体清除(alveolar fluid clearance,AFC)提供驱动力,减轻肺水肿,从而使急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的患者受益。现已阐明,ENaC主要受mTORC2/SGK-1信号通路的调控。Micro RNA(miRNA)是非编码微小RNA,能够在转录后水平调控其目的mRNA的翻译过程。已有研究发现,miRNA-7-5p参与了肿瘤细胞中mTOR的调控,但是在人肺泡上皮细胞中miRNA-7-5p调控ENaC的机制并不清楚,其能否在ARDS时影响ENaC的表达水平亦未见有报道。目的探讨miRNA-7-5p通过mTORC2/SGK-1信号通路对人肺泡上皮钠离子通道的调控机制。再进一步揭示急性呼吸窘迫综合症时人肺泡上皮miRNA-7-5p的表达变化与其在肺泡液体清除过程中起到的作用。由此丰富ARDS发病机制的分子生物学理论,并为该疾病的临床治疗提供新的线索。方法本研究由三部分组成第一部分:双荧光素酶报告基因系统验证miRNA-7-5p靶基因首先通过重组DNA质粒构建psiCHECK2-mTOR、psiCHECK2-mTOR-mut、psiCHECK2-SGK-1、psiCHECK2-SGK-1-mut共四组mRNA 3’-UTR中含有或不含miRNA-7-5p靶序列的重组报告基因。然后通过双荧光素酶报告基因系统分别证实mTOR、SGK-1是否均为miRNA-7-5p的靶基因。第二部分:mi RNA-7-5p调控人肺泡上皮细胞ENaC的机制研究转染miRNA-7-5p mimic上调肺泡上皮miRNA-7-5p表达水平后,qRT-PCR检测实验各组miRNA-7-5p、mTOR mRNA、SKG-1 mRNA表达水平,了解miRNA-7-5p对mTOR mRNA、SKG-1 mRNA的靶作用。再应用免疫印迹法(westernblotting)检测各组mtor、totalakt、p-akt-ser473、sgk-1表达水平,探索mirna-7-5p对mtorc2/sgk-1信号通路活性的调控作用。最后验证mirna-7-5p对enac各亚基表达水平的影响。第三部分:mirna-7-5p对lps诱导下人肺泡上皮细胞enac的调控机制研究使用lps刺激a549细胞以模拟ards时的病理状况,分别在0,3,6,12,24小时利用qrt-pcr检测细胞内mirna-7-5p的变化情况。使用lps刺激12小时后,转染mirna-7-5pinhibitor下调mirna-7-5p表达,再通过qrt-pcr检测mtor与sgk-1的mrna表达水平,免疫印迹法检测各组mtor、totalakt、p-akt-ser473、sgk-1表达水平,探讨抑制mirna-7-5p的表达在ards时对mtorc2/sgk-1信号通路活性的调控作用。最后继续应用免疫印迹法、免疫荧光显微镜检测mirna-7-5p对lps诱导下enac-α、β、γ三个亚基与mtor、sgk-1的表达影响。结果1.双荧光素酶报告基因系统验证mirna-7-5p靶基因通过targetscan预测发现mtor与sgk-1的3’-utr内都有mirna-7-5p的靶点序列。分别构建mtor与sgk-1mrna3’-utr中含有mirna-7-5p靶序列的野生型和突变型报告基因载体,与mirna-7-5pmimic或mirna-7-5pnegativecontrol共转染a549细胞后进行双荧光素酶报告基因检测发现,mirna-7-5p对于psicheck-2-mtor的荧光表达有非常显著的抑制作用,相对荧光强度下降至57%±5%(7.11±0.64与12.50±0.99),与阴性对照组比较差异具有统计学意义(p<0.01);而mirna-7-5p对psicheck-2-mtor-mut的荧光表达没有明显抑制作用(p>0.05)。我们还发现在建立的双荧光素酶报告基因系统中,mirna-7-5p对于psicheck-2-sgk-1的荧光表达也具有非常显著的抑制作用,相对荧光强度下降至45%±4%(5.12±0.46与11.49±1.48),与阴性对照组比较差异具有统计学意义(p<0.01);但是mirna-7-5p对psicheck-2-sgk-1-mut的荧光表达则没有明显抑制作用(p>0.05)。2.mirna-7-5p调控人肺泡上皮细胞enac的机制研究a549细胞分别转染mirna-7-5pmimic与negativecontrol后,通过qrt-pcr实验我们发现,mirna-7-5pmimic转染组中mtor的mrna表达水平较空白对照组和negativecontrol组出现了明显的降低,其表达水平仅为空白对照组的0.54倍(p<0.01);sgk-1的mrna表达水平较空白对照组和negativecontrol组也出现了明显的降低,其表达水平低至空白对照组的0.30倍(p<0.01)。接下来通过westernblot实验发现,mtor与sgk-1的蛋白表达同样出现了降低(p<0.01),同时,mtorc2下游磷酸化产物p-akt-ser473的表达降低(p<0.01)。这些结果表明,mirna-7-5p能够在细胞内抑制mtorc2/sgk-1信号通路的活性。然后应用westernblot检测发现mirna-7-5pmimic转染组enac-α、β、γ三个亚基的表达较空白组均出现了降低(p<0.01),这提示mirna-7-5p在肺泡上皮细胞内能够通过mtorc2/sgk-1信号通路够抑制enac的表达。3.mirna-7-5p对lps诱导下人肺泡上皮细胞enac的调控机制研究发现自100ng/ml浓度lps诱导后6小时开始mirna-7-5p的表达就开始升高(p<0.05),且随时间推移,其表达呈逐渐上升的改变,分别为lps诱导开始时的1.4、1.9与2.8倍(p<0.05)。这说明ards时,肺泡上皮细胞内mirna-7-5p的表达有明显升高。向lps刺激后的a549细胞分别转染mirna-7-5pinhibitor与negativecontrol,发现mtor与sgk-1的mrna表达水平较lps组与lps+negativecontrol组均出现了明显的回升(p<0.01)。westernblot实验发现,mtor,sgk-1与p-akt-ser473的蛋白表达也分别出现了升高(p<0.01)。这些结果表明,降低mirna-7-5p的表达能够在ards时恢复mtorc2/sgk-1信号通路的活性。同时westernblot实验与免疫荧光显微镜成像都证明enac亚基表达水平较单纯lps组均出现了明显的恢复(p<0.01)。这提示通过降低肺泡上皮细胞mirna-7-5p的表达能够提高enac的稳定性,逆转ards时低下的enac表达,从而可能起到增强肺水清除的效果。结论1.mtor,sgk-1都是mirna-7-5p的靶基因。2.mirna-7-5p能够通过mtorc2/sgk-1信号通路负向调控人肺泡上皮细胞钠离子通道的表达水平。3.ards时人肺泡上皮细胞mirna-7-5p表达升高,抑制mirna-7-5p的高表达水平能够恢复mtorc2/sgk-1信号通路的活性,逆转人肺泡上皮细胞钠离子通道的表达水平,提示其可能是治疗ards的新靶点。