β-胡萝卜素与肠道菌群相互作用研究

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β-胡萝卜素(β-carotene)作为转化效率最高的维生素A(VA)源而受到广泛关注,但β-胡萝卜素中的长疏水多烯链严重限制了其生物利用,不足10%的低吸收效率使其大量停留在大肠。人体肠道特别是大肠中栖居着众多的微生物,肠道菌群与营养元素相互作用对机体营养代谢、能量代谢和免疫调节等均影响显著。然而,大量不被吸收的β-胡萝卜素与肠道菌群之间的相互作用仍不明确。基于此,本研究通过体外厌氧发酵研究β-胡萝卜素与肠道菌群的相互效应,筛选鉴定肠道来源的β-胡萝卜素关键作用菌株,探明关键菌株与β-胡萝卜素的作用关系及蛋白组表达差异,进一步通过体内小鼠模型,验证关键菌株协同β-胡萝卜素对其体内吸收代谢的影响。从体外、体内、菌株挖掘、蛋白表达等多个层次阐明β-胡萝卜素与肠道菌群的相互作用效应。主要研究结果如下:1.通过构建体外消化体系与体外厌氧发酵体系研究了β-胡萝卜素在口腔、胃和小肠中的消化特性以及不同剂量β-胡萝卜素与肠道菌群的相互作用。结果表明:超过90%的β-胡萝卜素未经消化进入大肠与肠道微生物共存;β-胡萝卜素与肠道菌群共发酵24 h后,降解率达64.28%,较无菌群处理组提高1.46倍,VA生成量提高2倍;β-胡萝卜素作用下,体系短链脂肪酸(SCFAs)生成量增加到48.22±3.56 m M,较空白对照组提高2.26倍,其中乙酸、乳酸和丙酸的含量明显增加;β-胡萝卜素可以改变肠道微生物的组成,显著促进了Roseburia、Bacteroides和Lachnospiraceae的增殖,抑制了Dialister,Collinsella和Enterobacter菌属增殖(P<0.05)。2.通过体外菌群培养、分离、纯化,结合代谢产物分析,筛选得到2株肠道菌群来源的β-胡萝卜素高效利用菌株,经16S r DNA扩增测序鉴定2株菌分别为Lactobacillus gasseri和Lactobacillus paraplantraum,24 h培养后对β-胡萝卜素的降解率分别为34.12±1.94%和38.25±1.25%;对菌株生理生化特性进行分析结果表明,2株菌均在3~9 h达到生长对数期,不同碳源对菌株活性影响显著,当以乳糖为唯一碳源时,Lactobacillus gasseri与Lactobacillus paraplantraum的VA生成量最高,分别是其他碳源处理体系的3.0~10.7与1.7~2.8倍(P<0.05);进一步的光谱学分析结果显示两株菌蛋白与β-胡萝卜素的结合均导致了其280nm处的紫外吸收与340 nm处荧光猝灭以及二级结构的改变,且结合能力存在浓度效应,根据底物浓度表现为0.5 mg/m L>1.0 mg/m L>0.1 mg/m L。3.通过体外培养与外源添加β-胡萝卜素,利用i TRAQ定量蛋白组技术分析β-胡萝卜素对Lactobacillus gasseri蛋白表达的影响。蛋白组共鉴定得到466个蛋白,β-胡萝卜素处理后有152个蛋白差异表达,其中,69个上调,83个下调;GO功能富集分析显示,在152个差异蛋白中,有82个蛋白与代谢进程相关,KEGG富集分析显示,β-胡萝卜素添加能提高能量代谢通路中蛋白质表达量,促进机体产能,此外,β-胡萝卜素添加还促进了丝氨酸、谷氨酰胺、精氨酸的表达,进而影响氨基酸代谢通路。4.通过构建正常小鼠模型与组合抗生素处理的伪无菌小鼠模型,分别饲喂β-胡萝卜素或β-胡萝卜素+Lactobacillus gasseri,分析不同处理组β-胡萝卜素吸收代谢情况与肠道微生物变化。结果表明:β-胡萝卜素与Lactobacillus gasseri的协同处理显著增加了小鼠组织(尤其是肝脏)中β-胡萝卜素及其代谢产物的积累,变化最大的代谢产物视黄醇在肝脏中的积累是BC组(β-胡萝卜素处理组)的1.03倍;同时,显著降低了小鼠粪便中β-胡萝卜素含量,仅为21.8011±0.4060 mg/g,是BC组的15%左右;采用抗生素处理后,小鼠肝脏与小肠中β-胡萝卜素积累量较BC组分别下降了31.6%与27.6%,β-胡萝卜素代谢产物的积累下降了65.2%与14.1%,随后的Lactobacillus gasseri补充使β-胡萝卜素与总视黄酸酯积累有所增加,但无法逆转这一现象;此外,小鼠肠道菌群测序结果显示,β-胡萝卜素与Lactobacillus gasseri均显著影响了小鼠的肠道菌群结构,它们的协同处理显著促进了小鼠肠道内Lachnospiraceae、Rikenella、Anaerotryncus等菌属的相对丰度(P<0.05)。
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