【摘 要】
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目的:通过检测先天性巨结肠（Hirschprung’s disease,HSCR）患者狭窄段肠管组织中Lnc RNA MEG3表达水平、Rac1/Cdc42/PAK1信号通路中各蛋白的表达量以及在SH-SY5Y细胞系中调控MEG3及Rac1/Cdc42/PAK1信号通路后观察通路蛋白表达量、细胞增殖和迁移能力的变化探讨Lnc RNA MEG3调控Rac1/Cdc42/PAK1通路在先天性巨结肠发病
【基金项目】
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国家自然科学基金（82060100）；
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目的:通过检测先天性巨结肠（Hirschprung’s disease,HSCR）患者狭窄段肠管组织中Lnc RNA MEG3表达水平、Rac1/Cdc42/PAK1信号通路中各蛋白的表达量以及在SH-SY5Y细胞系中调控MEG3及Rac1/Cdc42/PAK1信号通路后观察通路蛋白表达量、细胞增殖和迁移能力的变化探讨Lnc RNA MEG3调控Rac1/Cdc42/PAK1通路在先天性巨结肠发病机制中的作用。方法:采用q RT-PCR（quantitative real time PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）法分别检测30例HSCR狭窄段肠管（HSCR组）与14例正常对照结肠组织样本（Normal组）中Lnc RNA MEG3和Rac1/Cdc42/PAK1信号通路中各蛋白的表达情况。体外实验以SH-SY5Y细胞株为研究对象,通过转染MEG3过表达质粒（pc DNA3.1-MEG3）和加入抑制剂AZA1调控MEG3的表达水平和Rac1/Cdc42/PAK1信号通路,应用Western Blot、CCK-8细胞增殖实验和Transwell迁移实验分别检测Control组（SH-SY5Y细胞）、MEG3组（SH-SY5Y细胞+pc DNA3.1-MEG3质粒）、MEG3+AZA1组（SH-SY5Y细胞+pc DNA3.1-MEG3质粒+抑制剂AZA1）和pc DNA3.1组（SH-SY5Y细胞+pc DNA3.1质粒）中Rac1/Cdc2/PAK1信号通路中各蛋白表达量以及细胞增殖和迁移能力。结果:（1）HSCR组中MEG3相对表达量低于Normal组（1.00±0.13 vs 2.56±0.58,P<0.01）。（2）HSCR组中Rac1/Cdc42/PAK1通路各蛋白表达量均明显低于Normal组（Rac1:0.20±0.05 vs 0.78±0.05;Cdc42:0.38±0.08 vs 1.03±0.08;PAK1:0.27±0.02 vs1.10±0.06;P-PAK1:0.24±0.03 vs 1.07±0.06,P<0.01）（3）MEG3组细胞增殖和迁移能力明显大于Control组（24h细胞吸光度值:0.21±0.00 vs 0.19±0.00,P<0.01,48h细胞吸光度值:0.31±0.01 vs 0.27±0.01,P<0.01;迁移的细胞数量:155.67±10.02 vs61.00±7.00,P<0.01）,Control组和pc DNA3.1组相比无显著差异（P>0.05）。（4）MEG3组中Rac1/Cdc42/PAK1通路各蛋白表达量均高于Control组（Rac1:0.96±0.05vs 0.46±0.11,P<0.05;Cdc42:1.12±0.08 vs 0.53±0.19,P<0.01;PAK1:1.02±0.09 vs0.55±0.14,P<0.05;P-PAK1:0.97±0.07 vs 0.66±0.08,P<0.05）,加入通路抑制剂AZA1干预后,MEG3+AZA1组中PAK1和P-PAK1蛋白表达水平低于MEG3组（PAK1:0.47±0.14 vs 1.02±0.09,P<0.05;P-PAK1:0.47±0.03 vs 0.97±0.07,P<0.01）,Control组和MEG3+AZA1组间Rac1、Cdc42、PAK1和P-PAK1蛋白表达量相比均无显著差异（P>0.05）。（5）MEG3组细胞增殖能力高于Control组（24h细胞吸光度值0.21±0.00 vs 0.19±0.01,P<0.01;48h细胞吸光度值:0.30±0.02 vs 0.26±0.00,P<0.05）,加入抑制剂AZA1培养后,MEG3+AZA1组细胞增殖能力低于MEG3组（24h细胞吸光度值:0.17±0.00 vs 0.21±0.00,48h细胞吸光度值:0.22±0.01 vs 0.30±0.02,P<0.05）,细胞培养24h后,MEG3+AZA1组与Control组间细胞增殖能力无显著差异（P>0.05）,培养48h后,MEG3+AZA1组细胞增殖能力低于Control组（细胞吸光度值:0.22±0.01vs 0.26±0.00,P<0.05）。（6）MEG3组细胞迁徙数量明显高于Control组（141.67±11.93vs 96.33±8.02,P<0.01）,加入抑制剂AZA1干扰后,MEG3+AZA1组细胞迁徙数量低于MEG3组（71.00±7.00 vs 141.67±11.93 vs 96.33±8.02,P<0.05）和Control组（71.00±7.00 vs 96.33±8.02,P<0.05）。结论:低表达的MEG3可能通过调控Rac1/Cdc42/PAK1信号通路抑制神经嵴细胞增殖和迁移能力,参与HSCR发生。
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