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【背景】在成年哺乳动物脑内有两个主要的神经发生区域,侧脑室下带（Subventricular zone,SVZ）和颗粒层下带（Subgranular zone,SGZ）,统称为神经龛。神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）以静息状态停留在其中,维持干细胞池,同时不断被激活,并分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,维持大脑的稳态,完成学习记忆,损伤修复等生理和病理过程。以啮齿类的侧脑室下带为例,神经龛内的干细胞在神经发生的过程中不断被激活成神经祖细胞,离开神经龛沿吻侧迁移流迁移至嗅球形成新生神经元整合入神经网络。随着年龄的增长,神经龛内神经发生过程逐渐减弱,稳态维持和损伤修复功能随之降低,神经退行性变、脑肿瘤的发生率增加,因此神经干细胞在维持哺乳动物神经系统稳态及修复中的作用至关重要。如何调控神经干细胞的静息与激活平衡,维持大脑的结构与功能稳态是重要的科学问题。目前利用干细胞的治疗有三种主要策略:一是使用神经营养因子刺激等基于细胞的方法改良神经细胞功能状态;二是使用外源性和体外培养细胞移植的细胞替代疗法;三是激活内源性神经干细胞/前体细胞或利用大脑内驻留细胞直接重编程的策略进行细胞替换。然而,不同的治疗策略也会有各自亟需解决的问题。在使用神经营养因子挽救细胞的策略中,神经营养因子难以有效的传递到神经元靶点;另一方面,外源性细胞移植可能造成神经元的异常连接,导致癫痫等严重后果。面对以上问题,我们把目光聚焦到了内源性神经干细胞静息/激活调控上。成年哺乳动物的脑内依然保存着神经发生的功能,如果能够合理而有效的调控内源性细胞激活,从而对神经系统疾病进行修复和功能改善,就能够避免神经营养因子治疗和外源性细胞移植治疗的风险和局限,为神经系统疾病的干细胞治疗找到新的路径和靶点。而内源性细胞治疗的关键是找到神经干细胞干性维持与增殖分化的关键调控分子。Ttyh1是一种跨膜蛋白,由Campbell于1993年在fli（flightless）基因座的一个区域中鉴定出来。既往研究认为,Ttyh1作为氯离子通道发挥作用。但通过前期的实验我们发现,Ttyh1可能在内源性神经干细胞的干性维持及增殖分化中起到关键性的调控作用。为了深入解析Ttyh1对神经干细胞的作用及其机制,我们设计并完成下列研究。【目的】1、分析Ttyh1在NSCs各阶段的表达分布特征;2、揭示Ttyh1对NSCs的干性维持及增殖分化的调控作用;3、阐明Ttyh1对NSCs调控的具体分子机制。【方法】1、利用现有数据库中单细胞测序数据,通过生物信息学分析Ttyh1在神经干细胞各阶段的表达分布情况;2、构建Ttyh1示踪小鼠,通过他莫昔芬诱导示踪荧光蛋白表达,在体分析Ttyh1的表达分布;3、通过慢病毒转染体外培养的神经干细胞,敲低Ttyh1的表达,观察神经干细胞生长的变化,以及分化的改变;4、采用Ttyh1 KO小鼠,通过对成年及老年小鼠大脑冰冻切片进行免疫荧光染色,分析对比Ttyh1在不同年龄阶段对神经干细胞的干性及分化的影响;5、通过对转染含有sh Ttyh1慢病毒的神经干细胞进行转录组测序,分析Ttyh1调控神经干细胞的分子机制;6、利用活性NFATc3过表达慢病毒转染Ttyh1敲低的细胞,进行表型挽救,验证NFATc3在Ttyh1调控神经干细胞的过程中起到的下游效应分子作用。【结果】1、单细胞测序数据分析显示,Ttyh1在主要分布于静息态神经干细胞和星形胶质细胞中,在静息态神经干细胞激活后表达量逐渐降低;2、Ttyh1示踪小鼠大脑冰冻切片免疫荧光染色显示,Ttyh1在SVZ区主要分布于侧脑室纹状体侧,在SGZ区主要集中于颗粒下带,并且与Sox2发生共标,与GFAP部分共标,与其他干细胞标志物EGFR、DCX以及室管膜细胞标志物CD24很少发生共标;3、在体外培养的神经干细胞中利用慢病毒敲低Ttyh1的表达发现,神经干细胞的生长形态发生改变,出现贴壁生长,并伸出神经突,免疫荧光染色结果显示,敲低Ttyh1后,Sox2阳性的干细胞和DCX阳性的神经母细胞比例降低,同时GFAP阳性的星形胶质细胞和O4阳性的少突胶质细胞增多,Map2阳性神经元减少,细胞向胶质细胞方向分化增多。4、对成年Ttyh1 KO小鼠大脑组织的免疫荧光染色显示,与对照组相比,敲除Ttyh1的成年小鼠神经干细胞增殖增强,并更多地从SVZ区迁出,分化成神经母细胞等后裔细胞。SGZ区神经干细胞的增殖分化也同样表现为增强;5、对老年Ttyh1 KO小鼠大脑组织的免疫荧光染色显示,与对照组相比,Ttyh1敲除的老年鼠神经龛内的干细胞数量大幅度下降,神经干细胞耗竭,同时Ttyh1 KO老年鼠脑内重复出现了病理性空洞;6、转录组测序结果显示,Ttyh1敲低后大量基因表达量发生改变,聚类结果显示钙离子信号通路发生显著变化;7、蛋白印迹（Western blot）及实时定量PCR结果显示,Ttyh1敲低后钙离子通路相关分子表达量降低,下游转录因子NFATc3下调显著;8、挽救实验显示,加入活性NFATc3过表达慢病毒后,可以部分挽救Ttyh1敲低所造成的神经干细胞表型的改变,NFATc3可以通过Cyclin D1和P21的表达平衡调控神经干细胞细胞周期。【结论】1.Ttyh1主要分布于神经龛内的静息态神经干细胞和星形胶质细胞中,在神经干细胞激活后逐步表达量降低;2.在体外培养的神经干细胞中敲低Ttyh1后,神经干细胞形态发生改变,干细胞比例减少,向胶质细胞方向的分化增加,Ttyh1存在可以维持神经干细胞的干性;3.敲除Ttyh1后,成年小鼠的神经发生作用增强,更多的神经干细胞被激活分化为后裔细胞,参与到神经网络构建;4.敲除Ttyh1后,老年小鼠神经龛内的干细胞显著减少,干细胞池耗竭,同时脑内出现病理性空洞;5.Ttyh1通过钙离子通路下游转录因子NFATc3调控周期蛋白Cyclin D1和P21的表达平衡来调节神经干细胞的细胞周期。