重组火鸡疱疹病毒rHVT-IFN-gB的构建

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自行设计并合成引物,用PCR方法扩增出了分子量分别为519bp和2101bp的鸡γ干扰素基因(ChIFN-γ基因)和马立克的gB基因。然后将chIFN—γ基因克隆于穿梭质粒pEGFP—C1中,构建的质粒命名为pC1-chIFN—γ,经过双酶切鉴定证明已将ChIFN—γ基因插入到了pEGFP—C1的多克隆位点中。gB基因的PCR产物克隆到pMD18-T载体中,构建的质粒命名为pT-gB,构建的质粒也用双酶切的方法进行鉴定。随后,我们从pT-gB中分离出gB基因,并将之连接到自行构建的载体pEGFP—C1中,构建的质粒命名为pC1-IFN-gB,经过双酶切鉴定证明将gB基因也插入到了pC1-chIFN-γ中。 从自行设计构建的基因表达盒载体pC1-IFN-gB上,用Apal Ⅰ和Nae Ⅰ酶切并分离出分子量为4958bp的基因表达盒,然后应用平端连接反应将表达盒插入到pTK2B载体的Nhe Ⅰ的单酶切位点位置,构建出含有chIFN-γ、gB和EGFP基因表达盒的转移质粒载体,并命名为pTKG-IFN-gB;从自行设计构建的基因表达盒载体pC1-chIFN—γ上,分离出分子量为3480bp的基因表达盒,并平端插入到pTK2B载体的Nhe Ⅰ酶切位点位置,构建出含有chIFN-γ和EGFP基因表达盒的转移质粒载体,并命名为pTKG-IFN-γ。 将自行设计构建的pTKG-IFN-gB用Pvu Ⅱ酶切,电泳回收后用脂质体方法进行转染,并用有限稀释的方法筛选重组病毒,转染的病毒在荧光显微镜上进行观察。经过笔者的摸索,发现适合本试验的最佳转染条件是:细胞的接毒量为0.5ml,脂质体的用量为25ul,转染时间为细胞接毒吸附2小时后培养8小时。初步筛选到了较为理想的重组病毒。 该重组火鸡疱疹病毒的获得,使得进一步研究它的生物学特性和预测它的应用前景变得切实可行。此外,本实验也为进一步研究ChIFN—γ对病毒活载体复制的影响提供了物质基础,并且可为阐释chIFN—γ做为基因工程活载体疫苗免疫佐剂的可能性提供实验依据。
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