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内部核糖体进入位点(IRES)序列是一种能够独立招募核糖体以表达蛋白的双顺反子序列,在构建多基因共表达载体的过程中发挥着重要作用。溶菌酶(Lysozyme, LYZ)是一种能够水解细胞壁内粘多糖的碱性酶,具有很广的抗菌谱,能够溶解革兰氏阳性细菌和部分革兰氏阴性细菌,甚至病毒也有一定的灭活作用。牛γ-干扰素(BoIFN-y)是细胞在受到适宜的刺激时,在特定的诱生剂作用下,分泌的一种微量的具有抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤,调节免疫功能的糖蛋白。因此,LYZ与BoIFN-y的联合使用对于奶牛乳房炎的防治具有很高的利用价值。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种由238个氨基酸组成的具有独特的发光机制的蛋白,最早发现于水母中,是新型的报告基因和定位标记物。腺病毒穿梭载体(Ad vector)因其外源基因表达效率高、瞬间表达,安全性好和易获得高病毒滴度的载体等特点,在基因工程上受到了广泛的应用。为了获得能高效表达人溶菌酶(hLYZ)与牛γ干扰素(BoIFN-γ)的双表达腺病毒载体,本实验分别从人和鼠的基因组中克隆出人胶原诱导蛋白(hVCIP) IRES序列,命名为hIRES和鼠胶原诱导蛋白(mVCIP) IRES序列,命名为mIRES;从含有人溶菌酶基因(hLYZ)的pCDNAK-LYZ载体上PCR扩增出hLYZ序列；从含有GFP基因的pEGFP-N1载体上扩增出GFP序列。经测序正确后,分别插入腺病毒穿梭载体Pshuttle-cmv的相应位点,构建获得Pshuttle-hLYZ-hIRES-GFP和Pshuttle-hLYZ-mIRES-GFP两种重组腺病毒载体。用脂质体法分别转染PK15. AAV293和牛肾细胞,经荧光显微镜观察和FACS检测,结果显示,两种IRES均成功介导了下游基因GFP的表达,不同的细胞中,报告基因GFP的表达量存在较大差别。用BoIFN-y替换GFP基因,获得Pshuttle-hLYZ-mIRES-BoIFN重组腺病毒载体,在AAV-293细胞内包装成腺病毒,经RT-PCR检测,结果表明,本实验成功获得了hLYZ和BoIFN-γ双表达腺病毒。