骨关节炎(osteoarthritis, OA)又称退行性关节炎,是一种慢性、渐进性的骨关节病变。它是在力学和生物学因素的共同作用下,软骨细胞,细胞外基质以及软骨下骨三者间分解和合成代谢失衡的结果。引起OA的病因复杂,具体的分子机制尚不清楚。先前研究表明：炎症、衰老和骨性关节炎的发生密切相关。抑制软骨细胞衰老可明显延缓OA发生。此外,在软骨中减少IL-1β的释放,或抑制IL-1p引起的下游生物学反应也可减轻软骨破坏,进而延缓OA进程。对软骨细胞衰老以及炎症调控的研究有利于我们进一步的解析OA发生的具体分子机制,为临床治疗提供新的思路。Sirt6属于Sirtuins家族一员,是一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,其生物学效应涉及抑制炎症、延缓衰老、稳定基因组等功能。目前Sirt6在软骨退变中的功能未见报道。本研究通过基因转染和基因沉默等手段在细胞、组织和动物模型中研究Sirt6在骨性关节发生中的重要作用。研究内容包括：1)Sirt6在骨性关节炎中的表达变化；2) Sirt6对软骨细胞衰老的影响；3)Sirt6对炎症因子刺激下软骨细胞功能的影响；4)Sirt6调控软骨退变的分子机制(通过NF-κB信号通路以及细胞自噬)；5)在动物模型中进一步验证提高Sirt6活性可以延缓骨性关节炎发生。本研究证明Sirt6是治疗骨性关节炎的重要分子靶标,为临床通过调控sirt6来治疗或者预防OA提供一定的理论依据。第一部分骨性关节软骨中Sirt6的表达变化目的：探讨软骨退变过程中Sirt6的表达变化。方法：取正常和骨性关节炎患者的软骨,冰冻切片,免疫荧光检测软骨中Sirt6的表达量,另分离培养原代软骨细胞,Western blot、RT-PCR比较Sirt6蛋白和mRNA表达差异。取2月和16个月龄的C57小鼠,取小鼠膝关节,免疫荧光比较膝关节中Sirt6的表达量。结果：免疫荧光显示骨性关节炎软骨中Sirt6的荧光强度明显减弱,分离培养的OA原代软骨细胞中Sirt6蛋白和mRNA表达量也明显降低,另外免疫荧光显示16月小鼠膝关节随着年龄自然退变,Sirt6的荧光强度也显著降低。结论：在骨性关节炎以及软骨自然退变进程中Sirt6的表达量显著减低。第二部分Sirt6对软骨细胞衰老的影响目的：探讨Sirt6对软骨细胞衰老的影响。方法：分离培养大鼠原代膝关节软骨细胞,体外连续传代致衰老,Western blot检测Sirt6蛋白的表达变化。借助慢病毒在软骨细胞中过表达Sirt6或敲低Sirt6,记录并比较各组细胞的最大传代次数,β-gal染色观察衰老细胞数。结果：软骨细胞体外传代培养,第20代时出现明显衰老征象。第2、10、20代软骨细胞Sirt6蛋白的表达量逐渐降低。Sirt6敲低的软骨细胞传代致第10代时即出现衰老征象,β-gal染色阳性率92.3%,而对照组阳性染色率仅为31%；过表达Sirt6软骨细胞可连续传代致第30代,取第15代细胞行β-gal染色,发现过表达Sirt6的软骨细胞β-gal染色的阳性细胞数明显小于对照组。结论：敲低Sirt6表达可以引起软骨细胞提前衰老,过表达Sirt6可以明显延缓衰老发生。第三部分Sirt6抑制炎症因子刺激下软骨细胞功能退变目的：探讨Sirt6对IL-1β刺激下软骨细胞退变的影响。方法：分离培养大鼠原代软骨细胞,IL-1β(10ng/ml)处理体外模拟软骨退变,Western blot及免疫荧光检测细胞Sirt6的表达变化。借助慢病毒在软骨细胞中过表达Sirt6,以空载为对照,IL-1β(10ng/ml)处理后Western blot比较软骨细胞中二型胶原、MMP13的表达差异。结果：软骨细胞IL-1β(10ng/mg)处理0、1、3及5天,Sirt6蛋白的表达随着作用时间的延长逐渐减少。软骨细胞IL-1p处理24小时,对照组细胞二型胶原的表达明显减少,MMP13的表达显著增高,而过表达Sirt6可以明显抑制胶原的降低和MMP13的增高。结论：炎症因子IL-1p刺激软骨细胞后细胞中Sirt6的表达明显降低,过表达Sirt6可以明显抑制IL-1β引起的软骨细胞功能退变。第四部分Sirt6调控软骨退变的分子机制目的：通过对NF-κB信号通路和细胞自噬的研究,探讨Sirt6调控软骨退变的分子机制。方法：(1)分离培养大鼠原代软骨细胞,借助慢病毒在软骨细胞中过表达Sirt6、空载以及Sirt6突变体(不能抑制NF-κB与其promoter区结合),IL-1β(10ng/ml)处理后免疫荧光和Western blot检测NF-κB亚基P65的核转位和细胞中IκB表达量的变化,RT-PCR比较NF-κB信号下游靶基因IL-6、MMP13及RANTES的表达,Western blot比较软骨细胞中二型胶原、MMP13的表达差异。(2)借助慢病毒在软骨细胞中过表达Sirt6以空载为对照,免疫荧光观察细胞中自噬泡的数量和Western blot检测细胞中LC3II/LC3I比例。结果：(1)过表达Sirt6后并不影响NF-κB亚基P65的核转位,IL-1刺激后细胞中IκB的表达量也显著降低。与野生型Sirt6相比过表达Sirt6突变体不能抑制NF-κB下游靶基因IL-6、MMP13及RANTES的表达,同时也不能抑制软骨细胞二型胶原表达减低和MMP13的增加,而野生型则具有良好的抑制效果。(2)过表达Sirt6后免疫荧光显示软骨细胞中自噬泡的量明显增多；Western blot检测细胞中LC3II/LC3I比例也显著升高。结论：NF-κB信号通路在Sirt6抑制软骨退变中具有重要作用,另外Sirt6介导的细胞自噬也在此过程中发挥了一定的功能。第五部分过表达Sirt6可以延缓小鼠骨性关节炎发生目的：通过小鼠OA模型体内验证Sirt6抑制骨性关节炎发生。方法： C57小鼠15只,分为假手术组、实验组和对照组,每组各5只,实验组小鼠膝关节造模后在关节腔中注射Sirt6慢病毒,对照组造模后注入空白慢病毒,假手术组单纯皮肤切开并注入空白慢病毒,并且在术后一月时追加注射病毒一次。术后2月取小鼠膝关节,组织切片,SO染色及OARIS评分比较关节退变程度。结果：假手术组小鼠术后2月膝关节SO染色显示：关节软骨结构完整,软骨表面光滑,软骨番红O染色颜色均匀,软骨细胞数目及软骨厚度正常。而对照组(OA造模+Lenti-NC)关节中局部软骨层完全消失,软骨下骨裸露,关节间隙变窄,剩余的软骨层明显变薄,软骨细胞数明显减少,软骨番红O染色颜色变淡。实验组(OA造模+Lenti-Sirt6)关节软骨存在纵向的裂隙,关节软骨的表面有薄层的丢失,局部较深,但范围较小。软骨厚度与假手术组相比无明显变化,关节间隙也较为正常,但实验组软骨表明番红O染色颜色明显变淡。组织染色根据OARIS评分假手术组为3.8±0.84,实验组为11.6±1.14,对照组为16.6±1.52,组间均存在统计学差异。结论：过表达Sirt6可以延缓小鼠骨性关节炎发生。