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研究背景:口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC,简称口腔鳞癌),是口腔最常见的恶性肿瘤,占口腔恶性肿瘤的90%,其恶性程度较高,五年存活率仅为50%左右,严重威胁人类健康,其中发生于舌黏膜者称为舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC,简称舌鳞癌)。E-钙粘素(epithelial cadherin,E-cad)是一种上皮细胞间粘附分子,属于钙依赖性跨膜糖蛋白。E-钙粘素在不同的连接蛋白的作用下,连接于不同的细胞骨架成分上,其细胞内结构域通过α、β连环素(catenin,cat)及p120连环素构成核心功能单元,由α连环素与一些相关蛋白结合后连接到肌动蛋白细胞骨架,或由α连环素直接与纤维状肌动蛋白连接。编码E-钙粘素的基因CDH1定位于16号染色体长臂上(16q22.1),全长约100Kb,由16个外显子和15个内含子组成,其中包含2.6kb的编码序列。E-钙粘素作为细胞间重要的粘附分子在个体发育、信号传导、基因调控及细胞的增殖发育方面有着重要的作用,同时也与许多肿瘤的发生有关。近年来,国内外有大量关于E-钙粘素与肿瘤的研究,尤其是在卵巢癌、乳腺癌、胃癌等领域,目前研究发现粘附分子E-钙粘素在人肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤中表达降低且具有普遍性。在成年脊椎动物中E-钙粘素是保持上皮细胞相互粘合的主要细胞间粘附分子,而在肿瘤组织中,定位于细胞表面的E-钙粘素的减少或消失,导致癌细胞易从瘤块上脱落,成为侵袭与转移的可能原因之一。本课题主要研究CDH1启动子甲基化及外显子突变在SD大鼠舌黏膜癌变各个病变阶段的发生情况,初步探讨化学致癌剂诱导的SD大鼠舌鳞状细胞癌发生的分子机制。研究目的:研究SD大鼠舌黏膜癌变各阶段CDH1基甲基化和外显子突变情况,为探索CDH1基因在舌鳞状细胞癌发生过程中的作用提供理论依据。材料和方法:1.在屏障系统中,采用含有质量分数为0.004%的4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4NQO)饮水饲养实验组75只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)SD大鼠以诱发舌黏膜癌变全过程,建立舌鳞状细胞癌动物模型。15只正常饮水的SPF级SD大鼠作为阴性对照。分别于饲养后第10、14、18、22、24周分为5批次处死实验组大鼠,并于24周处死对照组大鼠,即刻进行口腔舌黏膜组织取材,部分新鲜组织用甲醛固定、包埋、切片、苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后确定病变性质并做病理分级,对应的剩余新鲜舌黏膜组织置于-80℃保存备用。2.使用DNA提取试剂盒提取-80℃保存的对照组SD大鼠正常舌黏膜冻存组织基因组DNA,实验组SD大鼠上皮单纯增生组、轻度上皮异常增生组、中度上皮异常增生组、重度上皮异常增生组以及鳞状细胞癌组冻存舌组织基因组DNA。3.以对照组SD大鼠正常舌黏膜基因组DNA及SD大鼠舌黏膜癌变各病理阶段组织基因组DNA作为研究对象,以甲基化SD大鼠基因组DNA做阳性对照,去离子水做空白对照,利用特异性甲基化及非甲基化两对引物,进行CDH1启动子CpG岛甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR),以检测各组CDH1启动子CpG岛甲基化的水平及在舌鳞状细胞癌发生发展过程中的变化。4.以SD大鼠舌黏膜癌变各病理阶段舌黏膜组织基因组DNA作为研究对象,以正常饮水SD大鼠舌黏膜组织基因组DNA做为阴性对照,设计CDH1基因共16个外显子的上下游引物,应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增CDH1基因外显子1-16,提纯后进行测序,以检测舌黏膜癌变各阶段中CDH1外显子突变情况。结果:1.排除建立动物模型时死亡的大鼠、无病变的实验组大鼠及实验过程中的损失,最终得到62例SD大鼠舌黏膜组织基因组DNA,其中包括对照组正常舌黏膜15例,上皮单纯增生15例,轻度上皮异常增生10例,中重度上皮异常增生8例,舌鳞状细胞癌14例。2.MS-PCR结果显示SD大鼠舌黏膜癌变各阶段均未得到CDH1启动子CpG岛甲基化特异性产物,但都能检测出CDH1启动子非甲基化产物。3.对所有样品CDH1外显子1-16测序显示,仅有外显子13 mRNA第2106位发生碱基G→T错义突变,分别发生于中重度上皮异常增生组1例(12.5%)及舌鳞状细胞癌组5例(35.71%),舌鳞癌组与对照组、上皮单纯增生组、轻度上皮异常增生组三组相比差异有统计学意义(P<0.05),中重度上皮异常增生组与正常组及舌鳞癌组两组比较无统计学差异(P>0.05)。同时随病理分级程度的增高,CDH1外显子突变率呈升高趋势(P<0.01)。结论:在利用质量分数为0.004%4NQO饮水饲养的SPF级SD大鼠诱发舌鳞状细胞癌建立的动物模型中,对照组及实验组CDH1启动子CpG岛均未发生甲基化,实验组CDH1外显子13存在一疑似错义突变位点。4NQO饮水诱导的SD大鼠舌鳞状细胞癌发生、发展可能与CDH1外显子突变有关而与CDH1启动子甲基化无关。