传统的观念认为病理性血管重构的发生是一个“由内而外”的过程，由内管内皮细胞损伤始动，继而血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖，并合成、分泌大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白，最终导致血管结构和功能的改变。然而，通过抑制内皮损伤和对抗VSMCs增殖来进行的治疗性研究并没有完全阻断病理性血管重构的发生。近年来，血管外膜在血管重塑中的作用越来越受到人们的重视，并且提出“由外而内”的血管损伤重构假说，其中心观点认为血管损伤发生后，外膜是血管壁的第一感知部位。无论血管损伤是否累及外膜(严重与否)，对损伤反应活跃的细胞最先出现于血管外膜。血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts，AFs)是血管外膜中最主要的细胞成分，其在各种病理性损伤刺激下转化为肌成纤维细胞(myofibroblasts，MFs)，MFs是一种具有平滑肌细胞特征的成纤维细胞，表达平滑肌肌动蛋白-α (smooth muscle α-actin，α-SMA)，可以产生ECM和多种生物活性因子，MFs增殖并迁移至中膜和内膜，参与新生内膜形成及血管重塑过程。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG)是一个新近发现的血管稳态调控因子，其在成熟分化的组织和细胞中广泛表达，但在去分化组织或细胞，如鼠胚胎干细胞、人畸胎瘤细胞、造血干细胞和去分化表型VSMCs中却呈明显低表达或无表达状态。CREG可直接与外源性腺病毒蛋白E1A及哺乳动物体内转录因子E2F家族蛋白竞争性地结合在靶基因的启动子上，从而阻遏E1A和E2F对靶基因的激活作用，因而推测CREG可能通过与E1A、E2F竞争性抑制作用而起到促进细胞分化、抑制细胞增殖的作用。研究发现，在无特异性诱导剂存在的情况下，CREG仍可以单独诱导体外培养的畸胎瘤细胞向神经细胞分化。另外，CREG还具有维持心肌细胞和小肠上皮细胞成熟稳态、对抗病理性细胞损伤发生的生物学功能。本实验室前期系列研究证实，CREG基因在成熟分化的VSMC中大量表达，能够维持VSMC分化、阻遏在体损伤后VSMC向去分化表型转化并抑制新生内膜形成。因此，CREG是参与维持组织及细胞成熟分化稳态的重要调控因子。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号转导通路是生物体内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，参与介导细胞生长、发育、分裂和分化等多种生理及病理过程。在哺乳动物细胞中MAPKs亚族主要包括细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase1/2，ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Junamino-terminal kinase1/2，JNK1/2)和p38-MAPK。我们研究室前期在研究CREG调控人VSMCs凋亡过程时发现，CREG过表达通过抑制JNK1/2和p38-MAPK信号转导通路的激活来阻止药物诱导的离体培养的人VSMCs凋亡，同时，外源性添加CREG蛋白也能够抑制JNK1/2和p38-MAPK信号转导通路的激活来缓解球囊损伤诱导的人冠状动脉血管中VSMCs的凋亡。另外，关于CREG基因的其他研究小组也相继证实，CREG抑制心肌肥厚、纤维化和炎症作用的机制与ERK1/2信号转导通路密切相关。综上所述，CREG可作为MAPKs信号转导通路的上游调控子来影响多种组织细胞的生物学行为。本研究拟在整体和细胞两个水平复制AFs细胞表型转化模型，运用形态学、细胞生物学、分子生物学等技术，围绕血管损伤后CREG基因表达对血管外膜增生、AFs细胞表型转化，以及MAPKs信号转导通路在其中发挥的调控作用等方面的问题进行研究，以期通过阐明CREG基因对AFs细胞表型转化的调控作用及其机制，为拓展防治血管重塑性疾病的新思路奠定基础。本课题的主要研究内容和结果如下：1. CREG基因表达与AFs表型转化间的相关性研究。采用小鼠颈动脉血管损伤模型，免疫荧光染色观察血管损伤后外膜中α-SMA表达变化。结果发现，α-SMA仅在正常血管中膜表达，外膜没有表达，损伤1d后血管外膜开始增生，并有少量α-SMA表达，提示开始有AFs转化为MFs，损伤3d后血管外膜增生最明显，α-SMA在外膜中大量表达，而在损伤7d和14d后，外膜增生程度有所缓解，α-SMA的表达也逐渐减少；正常血管外膜大量表达CREG蛋白，损伤1d后CREG在外膜中的表达开始减少，损伤3d后外膜中几乎没有CREG表达，而在损伤7d和14d后CREG在血管外膜中的表达逐渐恢复。由此可见，损伤血管外膜中CREG的表达变化与α-SMA的表达呈负相关关系。采用贴壁法培养C57BL/6小鼠胸主动脉AFs，免疫荧光染色鉴定培养细胞的类型，发现其胞膜上不表达内皮细胞标志物CD31和VIII因子，胞浆内也不表达VSMCs标志物desmin和α-SMA，但表达波形蛋白(vimentin)，说明细胞是间质性来源，同时排除内皮细胞和VSMCs的参杂，可以确定培养的细胞为AFs。采用血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)作为诱发AFs表型转化的诱导剂，观察Ang II诱发AFs表型转化过程中CREG表达变化。Western-Blot结果发现，给予不同浓度Ang II (0、10nM、100nM、1μM和10μM)刺激24h或者给予1μM Ang II刺激不同时间(0h、12h、24h、48h、72h、96h和120h)后，AFs表达α-SMA逐渐增多，并且表现出时间和剂量依赖性特点；同时，1μM和10μM Ang II刺激24h后，AFs中CREG的表达量分别减少45.5%(p <0.01)和75.8%(p <0.01)；Ang II刺激后CREG的表达变化也表现为时间依赖性，1μM Ang II刺激24h后CREG的表达减少31.5%(p<0.01)，随着刺激时间的延长，CREG表达量逐渐减少，至120h后减少达98.9%(p <0.01)。应用Ang II1型受体阻断剂EMD66684(10μM)，Ang II诱发AFs表型转化及CREG表达下调的作用消失，而应用Ang II2型受体阻断剂PD123319(10μM)对AngII诱发的AFs表达α-SMA增加和表达CREG减少现象无影响，说明Ang II通过与其1型受体相互作用诱导AFs转化为MFs，同时下调细胞中CREG的表达。以上在体和离体实验均表明，AFs表型转化过程中CREG表达下调，提示CREG基因表达可能与AFs表型转化相关。2. CREG基因过表达抑制Ang II诱导的AFs表型转化。采用腺病毒载体转染法制备CREG基因过表达的小鼠原代AFs模型，应用Ang II(1μM，24h)诱发AFs表型转化，免疫荧光染色结果显示，Ang II诱导正常对照组和转染对照组中AFs表达α-SMA增多，而CREG基因过表达组能够对抗Ang II诱导的AFs表型转化。Western-blot结果表明，应用Ang II刺激后AFs中表达α-SMA明显增多(与正常对照组相比，719.4%±7.5%，p <0.01，n=3)，但表达CREG明显减少(与正常对照组相比，67.6%±5.5%，p <0.05，n=3)，CREG基因过表达能够上调AFs中CREG的表达(与Ad-GFP+Ang II刺激组相比，220%±4.8%，p <0.01，n=3)，同时抑制Ang II诱导的α-SMA表达增多(与Ad-GFP+Ang II刺激组相比，21.6%±4.7%，p <0.01，n=3)。以上提示CREG基因过表达可以抑制Ang II诱导的AFs表型转化。AFs受到Ang II刺激后转化为MFs，同时其增殖和迁移能力增强。为了进一步验证CREG具有调控AFs表型转化的作用，我们分别采用细胞计数、BrdU免疫组化染色和流式细胞周期分析的方法，检测CREG基因过表达对Ang II诱导的AFs增殖的影响。结果发现：腺病毒载体介导CREG基因转染AFs后2~4d CREG蛋白表达水平明显升高(与未转染组相比，2d，197.6%±33.5%，p <0.05，n=3；3d，482.7%±90.6%，p <0.01，n=3；4d，269.6%±52.4%，p <0.01，n=3)，CREG基因转染后2~5d，Ang II诱导的AFs增殖被显著抑制(与Ad-GFP+Ang II刺激组相比，2d，66.7%±9.7%，p <0.05，n=3；3d，63.3%±7.1%，p <0.01，n=3；4d，71.2%±5.4%，p<0.01，n=3；5d，77.5%±6.6%，p <0.01，n=3)，CREG基因转染后6~12d，AFs增殖情况与对照组相比无明显差异；BrdU免疫组化染色显示，应用Ang II (1μM，24h)刺激后，BrdU染色阳性细胞比例明显升高，而CREG基因过表达可显著降低BrdU阳性细胞比例(正常对照组为12.5%±7.3%，Ang II处理组为76.3%±9.7%，Ad-GFP+Ang II处理组为70.9%±11.4%，Ad-CREG+Ang II处理组为22.6%±6.8%；Ang II处理组与正常对照组相比，p <0.01，n=3；Ad-CREG+Ang II处理组与Ad-GFP+AngII处理组相比，p <0.01，n=3)；流式细胞周期分析发现，应用Ang II(1μM，24h)刺激后，G0/G1期细胞百分比明显降低，进入S期细胞比例明显升高，而CREG基因过表达可显著抑制AFs由G0/G1期进入S期(正常对照组G0/G1期细胞百分比为54.9%±6.3%，S期细胞百分比为2.4%±2.2%；Ang II处理组G0/G1期细胞百分比为41.8%±2.9%，S期细胞百分比为27.1%±5.4%；Ad-GFP+Ang II处理组G0/G1期细胞百分比为43.1%±5.8%，S期细胞百分比为26.3%±4.3%；Ad-CREG+Ang II处理组G0/G1期细胞百分比为50.5%±4.5%，S期细胞百分比为6.3%±4.3%；Ang II处理组与正常对照组相比，p <0.01，n=4；Ad-CREG+Ang II处理组与Ad-GFP+Ang II处理组相比，p <0.01，n=4)。上述研究结果提示CREG基因过表达可抑制Ang II诱导的AFs增殖。接下来，我们分别采用划痕实验和Transwell细胞迁移模型检测CREG基因过表达对Ang II诱导的AFs迁移的影响。结果发现：在Ang II的趋化作用下，AFs迁移活性明显增强，表现为划痕区域的细胞覆盖数目增加(1μM Ang II，24h)，迁移至Transwell下室的细胞数目增多(1μM Ang II，6h)，而CREG基因过表达明显减少划痕区域的细胞覆盖数目(进入无细胞区的细胞数：正常对照组为21±5个，Ang II处理组为47±4个，Ad-GFP+Ang II处理组为50±7个，Ad-CREG+Ang II处理组为33±5个；Ang II处理组与正常对照组相比，p <0.01，n=3；Ad-CREG+Ang II处理组与Ad-GFP+Ang II处理组相比，p <0.01，n=3)和Transwell下室细胞数目(正常对照组为16.5±2.5个，Ang II处理组为44.2±5.5个，Ad-GFP+Ang II处理组为47.4±4.8个，Ad-CREG+Ang II处理组为25.7±4.2个；Ang II处理组与正常对照组相比，p <0.01，n=4；Ad-CREG+Ang II处理组与Ad-GFP+Ang II处理组相比，p <0.01，n=4)，表明CREG基因过表达具有抑制Ang II诱导的AFs迁移的作用。综合上述研究结果，我们发现CREG基因过表达可抑制Ang II诱导的AFs表型转化、增殖和迁移。3. CREG通过阻断p38-MAPK激活抑制Ang II诱导的AFs表型转化、增殖和迁移。鉴于MAPKs、PI3K/Akt信号转导通路在调控细胞分化、增殖中的重要作用，我们首先采用Western-blot检测CREG基因过表达对Ang II诱导的AFs中MAPKs和PI3K/Akt信号分子表达的影响，结果显示：应用Ang II刺激AFs后，细胞中总的p38-MAPK、JNK1/2、ERK1/2、PI3K和Akt蛋白表达水平无明显变化，但其磷酸化水平显著上调(与正常对照组相比，p38-MAPK，279.1%±35.6%，p <0.01，n=3；JNK1/2，133.9%±4.2%，p <0.01，n=3；ERK1/2，156.2%±7.5%，p <0.01，n=3；PI3K，361.1%±9.5%，p <0.01，n=3；Akt，238.5%±4.8%，p <0.01，n=3)，CREG基因过表达可抑制Ang II诱导的p38-MAPK信号分子的活化(与Ad-GFP+Ang II处理组相比，56.1%±8.3%，p <0.01，n=3)，但不影响JNK1/2、ERK1/2、PI3K和Akt的磷酸化水平(与Ad-GFP+Ang II处理组相比，JNK1/2，104.3%±7.5%，p=0.27，n=3；ERK1/2，101.2%±5.5%，p=0.73，n=3；PI3K，95.8%±6.8%，p=0.35，n=3；Akt，98.6%±4.5%，p=0.22，n=3)。因此，研究结果表明CREG基因过表达可抑制Ang II诱导的AFs中p38-MAPK信号分子的活化。预先应用p38-MAPK选择性抑制剂SB203580或腺病毒载体介导p38αMAPK持续激活，再分别应用Western-Blot、BrdU免疫组化染色和Transwell细胞迁移模型检测CREG基因过表达对AFs表型转化、增殖和迁移的影响，通过此研究初步探讨CREG基因表达调控AFs表型转化、增殖和迁移的分子机制。结果显示：在SB203580(10μM)存在的情况下，Ang II仍然能够诱导AFs表达α-SMA增多(与对照组相比，175.0%±3.3%，p <0.01, n=3)，增殖能力增强(与对照组相比，181.7%±5.3%，p <0.01, n=3)，迁移增快(与对照组相比，175.0%±3.6%，p <0.01, n=4)；但是CREG基因过表达抑制Ang II诱导AFs表达α-SMA(与Ad-GFP+Ang II处理组相比，91.3%±4.2%，p=0.41，n=3)、增殖(与Ad-GFP+Ang II处理组相比，83.3%±11.5%，p=0.11，n=3)和迁移(与Ad-GFP+Ang II处理组相比，90.3%±6.8%，p=0.25，n=4)的作用消失；另外，在AFs内p38-MAPK信号分子持续活化的状态下，Ang II仍然能够诱导AFs表达α-SMA增多(与对照组相比，246.9%±10.3%，p <0.01，n=3)，增殖能力增强(与对照组相比，152.4%±11.7%，p <0.01，n=3)，迁移增快(与对照组相比，196.4%±10.3%，p <0.01，n=4)；但是CREG基因过表达抑制Ang II诱导AFs表达α-SMA(与Ad-GFP+Ang II处理组相比，101.5%±11.7%，p=0.13，n=3)、增殖(与Ad-GFP+AngII处理组相比，95.1%±5.2%，p=0.29，n=3)和迁移(与Ad-GFP+Ang II处理组相比，95.1%±5.2%，p=0.29，n=4)的作用消失，提示CREG通过阻断p38-MAPK激活抑制Ang II诱导的AFs表型转化、增殖和迁移。综上所述，本课题的研究结果发现血管损伤后，增生的血管外膜中CREG表达下调，而预示AFs向MFs表型转化的标志物α-SMA表达增加，同时，离体细胞模型同样发现，外源性应用Ang II诱导AFs表型转化过程中伴随CREG表达下调，在体和离体实验均提示CREG基因表达可能与AFs表型转化相关。应用腺病毒载体介导CREG基因转染AFs，建立CREG高表达的AFs细胞模型，外源性Ang II诱导AFs表型转化时发现CREG基因过表达抑制Ang II诱导的AFs表型转化、增殖和迁移。CREG基因过表达抑制Ang II诱导的p38-MAPK信号转导通路的激活，选择性阻断或持续激活p38-MAPK信号分子时，CREG基因过表达抑制Ang II诱导的AFs表型转化、增殖和迁移的作用消失，提示CREG通过p38-MAPK信号转导通路调控AFs表型转化。本课题初步揭示了CREG基因在AFs表型转化调控中的作用及通过对下游p38-MAPK信号转导通路的调控效应，有助于深入认识CREG基因对AFs生物学行为的调控作用及其机制，并为将来CREG基因临床应用奠定理论基础。