胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织公布的统计报告显示,2012年胃癌的发病率居各种恶性肿瘤的第5位,癌症死亡率居第3位。近年来研究人员利用基因敲除技术揭示了多种分子在胃癌发生发展中的重要作用。但是,由于之前研究所利用的胃癌小鼠模型是在全体细胞或者胃粘膜全层上皮细胞发生突变,无法明确胃癌发生的起始细胞究竟是哪种特定的细胞类型。所以,胃癌的细胞起源一直是该研究领域的热点科学问题。理论上来说,组织干细胞由于其持续的自我更新和长期存活的特性可能比分化成熟的细胞更易于成为肿瘤的起始细胞。但由于一直以来缺乏明确的分子标志物,胃组织干细胞的异常是否能够导致胃癌的发生缺乏直接的体内证据。2010年研究报道了第一个胃窦及胃-食管(小鼠对应的解剖结构是腺胃-前胃/食管)交接处的干细胞标记物Lgr5,但关于胃Lgr5~+组织干细胞在胃癌发生发展中的作用还存在着争议。之前的研究表明,胃Lgr5~+干细胞的异常仅能导致微腺瘤或者良性的腺瘤,而不能导致恶性胃癌的发生。另外,一些临床的数据发现胃癌样本中存在Lgr5~+的肿瘤细胞或者Lgr5的高表达,但也有一些临床研究发现Lgr5~+细胞在胃癌早期缺如,进一步质疑了胃Lgr5~+组织干细胞在胃癌发生发展中的作用。所以,我们提出了以下的科学问题:1)胃Lgr5~+干细胞是否是胃癌的细胞起源;2)胃Lgr5~+干细胞是否比分化细胞更容易起始胃癌发生;3)人胃癌样本中LGR5的表达及信号通路的失调如何?为了解决以上的科学问题,我们利用条件基因打靶技术在胃窦及胃-食管交接处的Lgr5~+干细胞中特异性地对TGF-β、Akt、Wnt和Kras等肿瘤相关重要信号通路的关键基因进行诱导修饰,并结合体内的细胞谱系示踪技术,考察Lgr5~+组织干细胞是否能够作为胃癌的细胞起源,分析肿瘤发生发展过程中干细胞自身的稳态维持、动员及其分化等的变化以及肿瘤中相关的分子和信号通路的改变,明确Lgr5~+组织干细胞在胃癌发生发展中的作用和机制。通过对三种分化成熟的细胞进行相同的基因改变,进一步分析胃Lgr5~+干细胞是否比分化细胞更容易起始胃癌的发生。最后结合TCGA数据库中大规模的人胃癌样本进行分析,进一步明确胃组织干细胞是否与人胃癌的发生和进展相关。胃窦Lgr5~+干细胞中特异性地敲除Smad4和PTEN导致65%(13/20)的小鼠在诱导后三个月内发生腺瘤,40%(8/20)发生浸润性的肠型腺癌。肿瘤细胞增殖旺盛且失去了分化成熟的能力。进一步分析肿瘤发生相关信号通路的改变,我们发现Smad4下游靶分子中与增殖密切相关的cyclin D1以及与转移密切相关的Spp1的表达明显升高,与增殖转移相关的MAPK、EGFR、Stat3等信号通路异常激活。接下来我们考察Smad4和PTEN的缺失对胃窦干细胞及其子代细胞的影响,结果发现双基因的缺失不影响胃窦Lgr5~+干细胞的数目,但导致前体细胞增多并抑制其向子代细胞的分化,提示来自突变的Lgr5~+干细胞的增殖细胞主要贡献了肿瘤早期的细胞构成。在胃癌进展过程中,我们发现在腺瘤以及腺癌的粘膜区Lgr5的表达依然位于底部,这与正常胃窦中Lgr5的表达谱相似。令人惊讶的是,在腺癌的浸润区Lgr5~+肿瘤细胞广泛散在性分布、增殖旺盛并高表达肿瘤干细胞的分子标记物CD44,提示我们Lgr5~+细胞可能促进胃癌的恶性转化以及浸润。另外在胃-食管交接处的Lgr5~+干细胞中敲除Smad4和PTEN也能够导致25%的小鼠发生浸润性的腺癌。此外,胃窦Lgr5~+干细胞中敲除Smad4和p53的同时激活Kras也能够导致小鼠发生腺瘤。这些结果证明突变的Lgr5~+干细胞能够起始胃癌的发生。接下来,我们考察胃Lgr5~+干细胞是否比分化细胞更容易起始胃癌的发生。我们选取了两种由Lgr5~+干细胞分化而来的细胞,结果发现在胃窦的顶细胞及胃体胃窦转换区的壁细胞中特异性地敲除Smad4和PTEN,在同样的时间内都不能导致胃癌的发生。另外胃体小弯处存在着一群Lgr5标记的分化成熟的主细胞,相同的遗传背景条件下Lgr5~+的主细胞同样不能起始胃癌的发生,证明胃Lgr5~+干细胞比分化成熟的细胞更容易起始胃癌的发生。最后,我们结合TCGA数据库中大规模的人胃癌样本数据进行分析,结果发现LGR5在胃窦以及胃-食管交接处的肠型胃癌中的表达均明显升高。此外,56%(61/109)的人肠型胃癌样本中SMAD4出现缺失和突变,33%(36/109)的人肠型胃癌样本中PTEN出现缺失和突变。SMAD4和PTEN基因的缺失直接导致了其RNA和蛋白表达的下降,并进一步导致了SMAD4和PTEN下游信号通路的失调。进一步分析发现SMAD4和PTEN在基因上的缺失更倾向于同时发生,而且导致了其RNA表达的协同下降,提示SMAD4和PTEN可能能够协同抑制人类胃癌的发生发展。这些结果都表明,人胃癌样本常伴LGR5的高表达以及SMAD4和PTEN信号通路的失调,与我们小鼠中得到的结果相一致,进一步提示人类中LGR5+干细胞中缺失SMAD4和PTEN也可能导致胃癌的发生。综上所述,本课题结论及原创性主要包括以下三点:1)证实胃Lgr5~+干细胞是浸润性肠型胃癌的细胞起源。我们利用条件基因打靶技术在小鼠成体胃窦和胃-食管交接处的Lgr5~+干细胞中特异性敲除Smad4和PTEN,在诱导3个月内小鼠逐步发生微腺瘤、腺瘤以及浸润性腺癌。2)证实了胃Lgr5~+干细胞比分化细胞更容易起始胃癌的发生;3)在大规模的人胃癌样本中发现LGR5的高表达,而且常伴SMAD4和PTEN基因的协同缺失及其下游信号通路的失调。本研究为理解人类胃癌发生的细胞学机制及分子机制提供了新的认识。此外,Lgr5~+干细胞不仅作为胃癌的起始细胞,还可能参与胃癌进展,这为胃癌的临床诊断以及细胞靶向治疗提供了新的理论基础和可能性。