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口腔癌是位居全身恶性肿瘤发病率的第六位,由于口腔癌的发病部位通常位于体表或者接近患者的体表部位,所以会严重影响口腔癌患者的正常生理功能和社会交往。口腔癌的治疗方式包括外科手术治疗、放射治疗、免疫治疗、基因治疗等等,但是在这些治疗方法中,外科手术治疗仍是占据着最重要的地位,也是最主要的治疗方法。静吸复合麻醉技术广泛应用于口腔癌的手术麻醉,静吸复合麻醉技术能够更好地维持患者术中的血流动力学稳定,同时患者有更快地术后恢复以及减少单一麻醉方式的麻醉药用量。异氟醚麻醉效能较强,血气分配系数低,易于控制术中的麻醉深度,故而广泛应用于静吸复合麻醉中。以往的多数研究表明,异氟醚具有诱导细胞凋亡的能力,异氟醚能够诱导新生大鼠神经元的广泛凋亡,同时能够诱导体外培养的淋巴细胞的凋亡;然而也有部分文献报道了异氟醚同时还具有抑制细胞凋亡的能力,异氟醚能够抑制应激状态下心肌细胞的凋亡。大部分口腔癌手术都需要进行同侧或对侧的颈淋巴结清扫术,因而手术持续时间一般较长,在手术麻醉中,静吸复合麻醉中的吸入麻醉药异氟醚是否会对口腔癌细胞的生物活性产生一定影响呢,是否影响口腔癌细胞的凋亡过程尚未见报道。目的本研究的目的旨在通过观察临床相关浓度的异氟醚对体外培养的口腔癌细胞系Tca8113和HSC2细胞的生物学行为的影响,为临床口腔癌手术选用更合理的复合麻醉方案和更合适的麻醉药提供细胞水平的理论依据。方法1.细胞培养:用来观察异氟醚对口腔癌细胞系Tca8113和HSC2细胞增殖能力的影响,同时用来观察Tca8113和HSC2细胞系的细胞周期。2.流式细胞术:用来观察异氟醚对口腔癌细胞系Tca8113和HSC2细胞凋亡能力的影响。3. Transwell小室:用来观察异氟醚对口腔癌细胞系Tca8113和HSC2细胞凋亡能力的影响。4. western blot:用来观察异氟醚影响口腔癌细胞系Tca8113和HSC2细胞凋亡时细胞通路的研究。结果1.在细胞增殖实验中,Tca8113和HSC2细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,继续培养72 h,以保证细胞系经过了两个细胞周期以上的细胞增殖过程,来观察细胞增殖能力的变化。实验结果首次发现接受2.0%异氟醚暴露后,无论是Tca8113细胞系,还是HSC2细胞系,细胞的增殖能力均发生了变化。Tca8113细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,与对照组没有接受异氟醚暴露的Tca8113细胞比,暴露组的细胞增殖能力均显著增高,且增高均有显著性差异(p<0.05)。暴露3 h组和暴露6 h组相比,暴露6 h组的细胞增殖能力增高更为明显,两组相比具有统计学上的显著性差异(p<0.05)。HSC2细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,与对照组没有接受异氟醚暴露的HSC2细胞比,暴露组的细胞增殖能力均显著增高,且增高均有显著性差异(p<0.05)。暴露3 h组和暴露6 h组相比,暴露6 h组的细胞增殖能力增高更为明显,两组相比具有统计学上的显著性差异(p<0.05)。结果证实了异氟醚能够在体外细胞水平上增强口腔癌细胞系的细胞增殖能力。2.在细胞凋亡实验中,Tca8113和HSC2细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,立即进行细胞凋亡的流式细胞仪检测。实验结果首次发现接受2.0%异氟醚暴露后,无论是Tca8113细胞系,还是HSC2细胞系,细胞的凋亡均发生了变化。Tca8113细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,与对照组没有接受异氟醚暴露的Tca8113细胞比,暴露6 h组的细胞凋亡水平显著降低,且降低具有显著性差异(p<0.05);而暴露3 h组的凋亡水平与未接受暴露异氟醚的对照组没有显著性差异(p>0.05)。HSC2细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,与对照组没有接受异氟醚暴露的HSC2细胞比,暴露组的凋亡均显著降低,且降低均有显著性差异(p<0.05)。HSC2细胞暴露2.0%异氟醚3 h组和暴露6 h组相比,暴露6 h组的细胞凋亡水平降低更为明显,两组相比具有统计学上的显著性差异(p<0.05)。结果证实了异氟醚能够在体外细胞水平上抑制口腔癌细胞系的细胞凋亡。3.在细胞侵袭实验中,Tca8113和HSC2细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,消化、离心、重新稀释成细胞悬液后接种于transwell小室的上室,放入细胞培养箱继续培养24 h,用HE染色的方法观察细胞穿越基底膜到达transwell下室的细胞个数。实验结果首次发现接受2.0%异氟醚暴露后,无论是Tca8113细胞系,还是HSC2细胞系,细胞的侵袭能力均发生了变化。Tca8113细胞系接受2.0%异氟醚暴露3到6 h后,与对照组没有接受异氟醚暴露的Tca8113细胞比,暴露组的细胞侵袭能力均显著增高,且增高均有显著性差异(p<0.05)。暴露3 h组和暴露6 h组相比,暴露6 h组的细胞侵袭能力增高更为明显,两组相比具有统计学上的显著性差异(p<0.05)。HSC2细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,与对照组没有接受异氟醚暴露的HSC2细胞比,暴露组的细胞侵袭能力均显著增高,且增高均有显著性差异(p<0.05)。暴露3 h组和暴露6 h组之间细胞的侵袭能力相比,两组之间没有统计学上的显著性差异(p>0.05)。结果证实了异氟醚能够在体外细胞水平上增强口腔癌细胞系的细胞侵袭能力。4.在细胞凋亡相关分子研究的实验中,Tca8113和HSC2细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,收集细胞,提取细胞的总蛋白,通过western blot方法来检测细胞水平凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。结果显示接受2.0%异氟醚暴露后,无论是Tca8113细胞系,还是HSC2细胞系,细胞的Bcl-2蛋白均发生了变化。Tca8113细胞系接受2.0%异氟醚暴露3～6 h后,与对照组没有接受异氟醚暴露的Tca8113细胞比,暴露组的Bcl-2蛋白显著增高,且增高均有显著性差异(p<0.05)。暴露3 h组和暴露6 h组相比,暴露6 h组的Bcl-2蛋白增高更为明显,两组相比具有统计学上的显著性差异(p<0.05)。HSC2细胞系接受2.0%异氟醚暴露3到6 h后,与对照组没有接受异氟醚暴露的HSC2细胞比,暴露组的Bcl-2蛋白显著增高,且增高均有显著性差异(p<0.05)。暴露3 h组和暴露6 h组相比,暴露6 h组的Bcl-2蛋白增高更为明显,两组相比具有统计学上的显著性差异(p<0.05)。结果说明异氟醚可能通过影响Bcl-2/Bax通路在体外影响培养的口腔癌细胞系细胞的凋亡。结论综上所述,2.0%异氟醚能够在体外增强口腔癌细胞的细胞增殖和细胞侵袭的能力,同时抑制了口腔癌细胞的细胞凋亡。这些结果表明在接受2.0%的异氟醚暴露后,口腔癌细胞的恶性程度增强,从而从细胞学水平证实了吸入麻醉药异氟醚可能并不适合于口腔癌患者的手术麻醉。