论文部分内容阅读
前言 卵巢癌的发病率在女性生殖道恶性肿瘤中占第三位，就诊时70％已届晚期。近年来有关卵巢癌的防治研究方面收效甚微，因此在女性生殖道恶性肿瘤中，卵巢癌是死亡率最高的一种肿瘤。大量资料证明：转移是影响预后的主要因素。即使在早期病例，卵巢癌脱落或游离的癌细胞也会常常出现在腹水或腹腔冲洗液中。即使外观上肿瘤包膜完整，近30％的Ⅰ、Ⅱ期病例有腹水或腹腔冲洗液游离癌细胞阳性。总体而论，卵巢癌有的腹膜转移率超过50％，且随期别的上升而明显增加。因此，研究卵巢癌的腹膜转移规律，进而采取行之有效的阻断治疗措施，已成为提高疗效的关键，也是国内外卵巢癌治疗研究的热点课题。近年来，研究已经证明，α2β1、α3β1整合素（integrin）是介导卵巢癌细胞与腹膜接触的主要粘附分子。 新疆紫草素是一种从紫草根中提取出来的一种萘醌类化合物。已有研究表明紫草素是抗炎症的有效成分。已发现紫草素对多种肿瘤，如小鼠腹水型肉瘤S180、原发性乳腺肿瘤、恶性葡萄胎等起抑制作用。研究发现，新疆紫草素能有效诱导人大肠癌细胞发生程序性细胞死亡（细胞调亡），对人胃癌细胞（BGC823）和人食道癌细胞（Egal09）也具有明显的抑制作用。但紫草素对卵巢癌细胞的抑制作用的研究目前尚未见报道。 90年代，紫杉醇（TAXOL）成为卵巢癌复发耐药患者的首选药物，目前已作为卵巢癌术后的常规一线化疗药。近年来国内外针对该药对卵巢癌的治疗进行了全面研究，证实紫杉醇对治疗卵巢癌安全、有效，既可单用，亦可联合应用；单药治疗和联合化疗均取得较高的临床缓解率，化疗过程中出现的毒副作用多可耐受，且紫杉醇周疗的副作用较月疗为轻。但紫杉醇对卵巢癌细胞腹膜种植抑制作用的研究国内还尚未见系统报道。 本研究拟将聚乙烯二丙胺（apPEG）交联精-谷-天冬氨酸三肽（RGD），利用其高分子化合物的缓释作用，增强RGD活性，减少蛋白酶水解，延长其半衰期及延缓腹膜吸收，使之能够有效地阻抗卵巢癌细胞与细胞外基质粘附，并在体外实验模型和裸鼠腹腔种植模型中系统观察RGD-ap-PEG杂交肽协同紫杉醇、紫草素阻抗癌细胞粘附、侵袭及抑制卵巢癌细胞增殖、诱导其凋亡的作用，以及构建观察CD44、β1整合素的反义寡核苷酸分子，旨在为防治卵巢癌腹膜种植性转移提供新的阻断治疗策略。材料与方法 1.细胞培养: ①人卵巢癌细胞株CAOv3及小鼠成纤维细胞NIH3竹的培养:在含10%胎牛血清，loou/血青霉素，100林扩祖链霉素的RpMll64o培养基中贴壁生长，于37℃、5%C02、95%空气培养箱中传代培养。 ②NIH3竹细胞条件介质制备:细胞常规培养至80%融合，用含0.01%小牛血清白蛋白（BSA）培养液培养24h，取培养液10009离心10而n，取上清，一20℃保存。 2.RGD一PEG杂交肤、cD44和整合素pl基因反义寡核昔酸的构建: RGD三肤由深圳市翰宇生物工程有限公司合成、提纯。并采用异丙基碳化二亚胺（DIC）方法使apPEG与天冬氨酸经基结合，在此基础上分步合成甘氨酸一天冬氨酸多肤。RGD一apPEG杂交肤交联过程的中间产物用分子筛色谱法纯化，终末产物经高压液相色谱法（HPLC）纯化，氨基酸序列分析确认。应用生物信息学技术确定CD44、整合素p，基因序列，设计反义核酸及随机序列对照片段，合成寡核昔酸片段、并用生物素标记。 3.MTI’法测定细胞杀伤率: 收集对数生长期细胞，接种于%孔板，加人相应的处理因素，阴性对照组每孔加人100闪培养液，阳性对照组加入等量的培养液及DMSO。培养24、48、72h，各孔加人50林IM竹（lm岁而），继续培养4h后弃上清，加人150林mMso震荡溶解10而n，酶标仪492run波长下测吸光度（A）值。杀伤率公式为（A用药一A阴性姗）/（A阳性朋一A阴性舰）。 4.癌细胞粘附力测定: ①取%孔培养板，覆以Matrigels林扩孔，4℃过夜;娜7℃孵育lh，无血清培养液洗两次;③加预处理的癌细胞悬液，1 xlo礴/孔，37℃摇床100印m缓慢振荡30而n;④PBS洗两次;⑤弃上清，无血清培养液洗一次;⑥加无血清培养液巧o闪及M竹（lmg/耐）50讨;助7℃继续孵育4h;⑧弃上清，每孔加人100闪DMSO原液，振荡摇匀2而n;⑨酶标仪在490nm单波长下测定OD值。细胞粘附率=（实验组OD值/对照组OD值）x 100%。每组实验均重复三次。 5.癌细胞侵袭力测定: 自制改良的Boyden小室模型。①Boyden小室置于冰浴，下室加人NIH3竹细胞条件介质（200沙室）;②上下室之间置8林m微孔滤膜，膜上铺100泌无血清培养液稀释的Matrigel80卜g;③37℃孵育lh;④上室加预处理的癌细胞悬液（4 x ro4/200泌）;⑤培养20h;⑥弃去上室培养液，棉拭子轻轻将微孔滤膜上面的Matrigel及残留的癌细胞擦净;⑦取出滤膜，95%酒精固定30而n，苏木素染色;⑧显微镜下计数200倍视野中侵袭至滤膜背面的细胞数，每次计数5个视野，取均值。 6.流式细胞仪测定细胞周期: ①场psin一EDTA消化后，4℃预冷的PBs吹打成单细胞悬液，移人10Inl离心管中，离心1000印m，8 min;②4℃pBS，1000印m，3而n离心二次，弃上清;③一20℃预冷的70%乙醇4℃固定4