自从1958年耶鲁大学的科学家Lerner从牛的松果体中首次分离出褪黑素以及1995年Dubbels和Hattori等学者率先从高等植物番茄、牵牛花等植物中鉴定到褪黑素以来,褪黑素在动植物中的功能受到了科学家们的广泛关注和研究。大量研究表明:褪黑素能够参与到植物生长发育的各个阶段,参与调控植物的各种生理活动;在动物体内,褪黑素起着重要的时间生物学作用,调节昼夜节律,维持节律稳定,具有改善睡眠、治疗神经衰弱和提高免疫等功效。因此,褪黑素在日常生活中作为睡眠调节药物被广泛使用,常用于调整由飞行时差或其他睡眠失调导致的生物钟紊乱,从而改善人的睡眠觉醒周期和昼夜节律。随着我国经济的全球化和快速发展,人们由于频繁时差切换和高强度轮班工作等无规律生活节奏而导致其体内褪黑素分泌合成失调并引起昼夜节律失调的现象也越来越多。许多研究表明通过经常进食高褪黑素含量的动植物食药材能有效补充人体内褪黑素含量并维持其代谢稳态而改善昼夜节律失调。因此,寻找和研究褪黑素高含量的动植物食药原料,特别是高褪黑素含量的大众植物食药原料具有重要现实价值。桑树（Morus alba L.）原产于中国,一直作为家蚕饲料而被大量种植,自古以来便是中国主要经济作物之一。以往对桑树的研究,主要集中在桑树品种选育、桑树栽培和病虫害防治等方面,其目的是为家蚕提供高产、优质的桑叶饲料。随着对桑树的深入研究,发现桑树不同部位富含多种营养成分和活性物质,使得其营养价值和药用价值也受到人们的关注,因而被国家卫生部列为“药食同源”的植物资源。最近研究表明与其他许多中药材和水果相比,桑叶和桑葚都属于高褪黑素含量植物资源,被认为是补充褪黑素最佳原材料之一。有研究表明同一植物物种内不同栽培品系或种质间褪黑素含量差异巨大,我国是桑树种质资源最丰富的国家,不同桑树种质资源圃收集并保存着大量的种质资源。因此,从大量桑种质资源中筛选出高褪黑素含量的桑品种或种质不但可作为人们日常生活中褪黑素补充合适的植物原料,也能为研究桑树高效褪黑素分子合成机理提供研究材料,具有重要的现实和科学意义。目前为止,为数不多的桑树褪黑素研究报道主要集中在其鉴定和含量测定方面,而桑树种质资源褪黑素及其异构体种类的系统鉴定、含量测定、高含量种质筛选及其生物合成分子机制尚未见报道,极大阻碍了桑树作为高效补充人体褪黑素大众原料的应用及其深度开发和多元利用。综上所述,本研究首先利用UPLC-MS/MS检测技术鉴定不同桑树品种/种质的褪黑素,并对50个不同桑树品种/种质褪黑素含量做定量分析筛选出褪黑素含量最高的桑树品种/种质。其次,利用生物信息学方法,从褪黑素含量最高桑种质—川桑（M.notabilis）全基因组数据库中鉴定出参与褪黑素生物合成相关基因,并开展表达谱分析,筛选参与褪黑素高效合成关键基因并开展体外酶活实验,阐明川桑高效合成褪黑素的分子机制。在桑树褪黑素鉴定实验中意外鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体并对不同品种桑树褪黑素异构体进行了定量分析。为了获得桑叶最佳收获部位和季节,对影响桑树中褪黑素和异构体总含量的非遗传因素也做了初步探究。由于本研究首次在植物组织中鉴定到天然褪黑素异构体,加上有关褪黑素异构体生物合成途径从未见报道过,故选取四个桑树品种不同组织为材料,用UPLC-MS/MS鉴定其不同组织中的褪黑素和异构体。同时利用qRT-PCR分析褪黑素生物合成相关候选基因的表达量,并筛选出可能参与褪黑素异构体生物合成的靶标基因,开展其体外酶活功能的验证分析,拟阐明桑树褪黑素异构体生物合成分子途径,为进一步解析其生物合成分子机理奠定了良好的基础。所获得的结果如下:1.不同桑树品种/种质褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选利用UPLC-MS/MS在鉴定不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量过程中,鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体。在50个不同的桑树品种中,1个桑树品种/种质仅含有褪黑素,42个桑树品种仅含有褪黑素异构体MI-1,而其余7个既含有褪黑素又含有MI-1。为了探究不同桑树品种/种质之间褪黑素含量的差异,分析了50个不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量。结果表明桑树中褪黑素含量为0.26至0.83 ng/g,相差3倍,最高五个桑种质依次是川桑、西农6071、神农架长穗桑、嘉陵16号和嘉陵20号。褪黑素及其异构体的总含量为0.23至20.58ng/g,相差89倍,最高五个桑种质依次是策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、印度桑和甘洛6号。根据测定结果表明川桑、西农6071、神农架长穗桑可作为最佳补充褪黑素的原材料。为了探究环境条件对桑树褪黑素及异构体的影响,利用UPLC-MS/MS检测了不同采摘时间和不同成熟度的桑叶中褪黑素及异构体含量。结果表明褪黑素及其异构体总含量随着采摘时间的先增加后降低,随着叶片成熟度的增加逐渐增加。以上研究结果表明,在6月28日,第20叶位采摘策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、叶片可获得最高褪黑素和异构体含量的桑叶原料。2.川桑（Morus notabilis）褪黑素高效生物合成分子机制解析褪黑素含量最高桑种质为川桑,在川桑基因组数据库中鉴定到37个褪黑素生物合成相关候选基因。以“川桑”为模板成功克隆到37个褪黑素生物合成相关的候选基因,即:一个色氨酸脱羧酶基因（MnTDC）,7个色胺5-羟化酶基因（MnT5H1-7）,6个5-羟色胺N-乙酰基转移酶基因（MnSNAT1-6）基因,20个N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶基因（MnASMT1-20）和3个咖啡酸-氧-甲基转移酶基因COMT（MnCOMT1-3）。生物信息学分析表明桑树中褪黑素合成相关候选基因的结构特征与已经报道的褪黑素生物合成相关基因基本一致。结构域预测和多序列比对分析表明这些蛋白质都具有各蛋白家族催化活性所需的结构域和活性位点。利用qRT-PCR技术研究了褪黑素生物合成相关基因在川桑根、茎、叶和皮中的表达情况,结果表明这些基因在各组织中的表达模式不一,同一家族的不同基因表达量差异较大。MnTDC基因在川桑叶中的表达量是最高的。T5H1和T5H2相比较其他5个T5H基因在根、茎、叶和皮中的表达量较高,T5H7在四个组织多种的表达较低。SNAT1-SNAT5这5个基因的表达模式一致,但SNAT5基因在茎中的表达量是SNAT1的在茎中表达量的20倍。而SNAT6在4个组织中几乎不表达。20个ASMT基因中,ASMT12基因的在根和皮中的表达量是最高的,ASMT3基因在4个组织均不表达,除此之外其他的18个ASMT基因在4个组织中的表达量差异较大。MnCOMT1在茎中的表达最高。构建原核表达载体pCold TF-MnTDC、pCold TF-MnT5H2、pCold TF-MnSNAT5、pCold TF-MnASMT12和pCold TF-MnCOMT1,转入大肠杆菌,分别表达这5个重组蛋白并获得相应可溶的重组蛋白。体外酶活表明MnTDC重组蛋白与底物色氨酸在缓冲液中共孵育鉴定到产物色胺。MnT5H2重组蛋白与底物色胺在缓冲液中共孵育鉴定到产物5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与底物5-羟色胺、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到产物N-乙酰5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与5-甲氧基色氨、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到褪黑素。MnASMT12重组蛋白分别与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnASMT12重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。MnCOMT1重组蛋白与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnCOMT1重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。前人关于ASMT蛋白家族的研究表明,ASMT蛋白家族被分为三个亚家族（I,II,III）,但仅有一个亚家族的成员编码的蛋白表现ASMT蛋白酶的活性。在川桑中MnASMT12属于MnASMT蛋白家族的第I亚族,催化N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素,5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。为了探究MnASMT蛋白家族第II亚家族和第III亚家族成员的功能,我们根据MnASMT各亚家族基因的表达量,选择MnASMT第II亚家族的MnASMT16和第III亚家族的MnASMT20进行进一步研究。将重组的载体pCold TF-MnASMT16和pCold TF-MnASMT20在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,分别获得MnASMT16和MnASMT20重组蛋白。将N-乙酰5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液混合和孵育,用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明MnASMT16和MnASMT20都具有将N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素的能力。此外,将5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液进行共孵育,并使用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明只有MnASMT20重组蛋白将5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。总而言之,酶动力学和体外偶联测定结果表明桑树的褪黑素生物合成不但有多条不同途径,而且所有条途径都能有效地催化色氨酸转化为终产物褪黑素。此外,ASMT基因家族中三个亚家族基因编码的蛋白都有ASMT蛋白酶活性。以上结果表明,川桑可通过多途径、多基因能高效地催化色氨酸向褪黑素转化,可能是其保持丰富褪黑素含量的关键分子机制。3.桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析我们使用相同的桑树品种的不同的组织为实验材料,并利用相同提取和检测方法开展了褪黑素及其异构体的鉴定和定量分析。研究结果表明4个桑树品种褪黑素异构体的种类也有差异。4个桑树品种叶片中都含有褪黑素和两种褪黑素异构体（MI-2和MI-3）,果中仅含有褪黑素和异构体（MI-2）,其中“大十”叶和果中褪黑素及其异构体总含量都是最高的。利用qRT-PCR分析了褪黑素合成相关基因在两个桑树品种“大十”和“白玉皇”的叶、果中的表达情况。结果表明,除MaASMT4和MaASMT20都具有桑叶特异性高表达的模式外,其他参与褪黑素生物合成的基因在两个品种和两个器官的表达模式均不一致。为了进一步确认MaASMT4和MaASMT20两个基因桑叶特异高表达的模式,利用qRT-PCR分析结果表明MaASMT4和MaASMT20在“嘉陵30陵和“中桑5801MT都具有桑叶特异性高表达的模式,这种表达模式与MI-3特异存在叶中的模式一致。因此,将MaASMT4和MaASMT20两个基因作为合成褪黑素异构体MI-3的关键基因进行进一步的分析。以“大十”为模板克隆了MaASMT4和MaASMT20基因并构建原核表达载体pCold TFMaASMT4和pCold TF-MaASMT20,转入大肠杆菌表达其蛋白。外源表达的MaASMT4和MaASMT20重组蛋白体外酶活分析结果表明:属于ASMT基因家族第III亚家族的MaASMT4和MaASMT20在体外都能催化底物N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素异构体MI-3。为了探究MaASMT蛋白家族第I和第II亚家族成员的功能,基于其他两个亚家族不同基因的表达量,以“大十”员为模板克隆了ASMT基因家族第I和第II亚家族的MaASMT9和MaASMT16基因。构建原核表达载体的pCold TF-MaASMT9和pCold TF-MaASMT16转入大肠杆菌表达其重组蛋白。体外酶活结果表明ASMT蛋白家族第I亚家族的MaASMT9和第II亚家族的MaASMT16两个重组蛋白都能催化N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素。这些结果表明褪黑素异构体生物合成分子途径与褪黑素相似,白桑能用特定亚群的ASTM成员实现其体内褪黑素异构体的合成,为进一步植物褪黑素异构体生物合成分子机理解析打下了良好的基础。