本研究采用口腔微生物学与分子生物学基础技术，通过化学合成变形链球菌密度感应CSP信号肽，激光共聚焦显微镜、扫描电镜等对比观察密度感应CSP信号肽对变形链球菌生长及生物膜形成能力的影响，采用实时荧光定量RT-PCR检测生物膜状态中变形链球菌密度感应相关基因以及下游基因的表达。旨在探索口腔变形链球菌在生物膜状态中密度感应系统具体的调控过程以及对下游毒力因子相关基因的具体调控作用，从细菌表型、基因转录调控等层面上全面清楚地认识密度感应的调控作用。为进一步阻断细菌间的信号传递，控制口腔菌群的感染和菌斑生物膜的形成提供新的治疗思路。 第1章变形链球菌密度感应CSP信号肽的固相合成和鉴定。 研究目的：人工合成变形链球菌密度感应CSP信号肽及鉴定。方法：应用固相多肽合成仪采用Fmoc/PyBOP合成法合成变形链球菌streptococcusmutansUA159comC基因编码的26-46位氨基酸序列NH2SGSLSTFFRLFNRSFTQALGKCOOH，通过高效液相色谱仪采用C18反相柱子进行合成多肽纯化，质谱分析技术对合成产物进行检测，通过检索SWISS-PROT蛋白质数据库对多肽的氨基酸组成及功能初步分析。 研究结果：准确合成21个氨基酸的CSP蛋白多肽序列，实际分子量为2364.7，纯度达90％以上；通过SWISS-PROT蛋白质数据库中的ExPASy序列分析系统对合成序列进行分析，分子式为C108H166N30O30、预期分子量为2364.69，理论pI值为12.01；进一步的SignalP3.0Server分析显示该合成的蛋白多肽为非分泌性信号肽；合成多肽序列的质谱分析结果与蛋白质数据库检索信息相符。 研究结论：成功合成变形链球菌CSP信号肽，为变形链球菌密度感应作用机制研究奠定基础。 第2章密度感应对口腔变形链球菌生长及生物膜形成影响作用的实验研究。 研究目的：观察密度感应CSP信号肽对野生型变形链球菌生长及形成生物膜的影响，从细菌表型层面上认识密度感应的调控作用。 研究方法：通过酶标仪检测变形链球菌加入CSP组(实验组)和不加CSP组(对照组)的培养生长菌悬液的吸光度，以及变形链球菌生物膜染色脱色后脱色液的吸光度；采用激光共聚焦显微镜和扫描电镜分别对变形链球菌实验组和对照组生物膜立体结构、细菌密度、活菌死菌比例以及生物膜内细菌形态等对比观察。 研究结果：①在4h、6h、12h、24h各个时间变形链球菌实验组和对照组培养液中测定的浮游细菌生长菌悬液光密度OD600值，经统计分析，两组间均值比较均无统计学意义；②在4h、6h、12h、24h各个时间变形链球菌实验组和对照组培养板底壁生物膜染色脱色后，取染色液测定其光密度OD490值，通过统计分析，4h、6h时两组间无统计学差异，12h后实验组生物膜染色液的光密度OD值是对照组的1.34倍，24h后实验组生物膜染色液的光密度OD值是对照组的OD值的1.689倍(P＜0.01)；③变形链球菌生物膜激光共聚焦显微镜对比观察表明：与对照组相比，12h和24h的实验组生物膜绿色荧光面积GFA、厚度、活菌比例均显著增高。其中，12h生物膜实验组的TFA是对照组的1.29倍(P＜0.01)，24h后实验组的TFA是对照组的2.06倍(P＜0.05)，24h生物膜实验组的GFA是对照组的2.9倍(P＜0.01)，厚度增加13.9％(P＜0.05)。而RFA差异变化不大。④生物膜扫描电镜对比观察结果：对照组细菌呈单个散点状稀疏分布，或成散在单个堆积成团，细菌排列堆积呈球状、散沙状；实验组细菌呈均匀呈团状密集分布，细菌之间由厚实的粘性胞外分泌物将细菌之间粘连、呈链团状。 研究结论：①密度感应对浮游变形链球菌的生长繁殖无显著影响作用。②密度感应在变形链球菌生物膜形成中增加生物膜细菌密度、活菌比例以及厚度，促进变形链球菌生物膜的形成。 第3章口腔变形链球菌密度感应基因自身调控作用的研究。 研究目的：实时定量检测密度感应相关com基因家族的comC、comE、comX基因的表达，基因转录调控层面上认识密度感应系统基因自身调控作用。 研究方法：厌氧培养变形链球菌24h后，取出黏附菌膜的玻片置于新鲜TSB培养基中，加1μg/mlCSP信号肽，37℃厌氧培养0h，1h，2h，3h，4h，5h各时间点一步法提取总RNA，逆转录后，采用SYBRGreen1PCR对comC、comE、comX基因及内参16SrRNA扩增，实时定量检测comC、comE、comX基因在不同时间段的表达情况。 研究结果：comC、comE、comX基因表达变化趋势呈现基本一致的情况，即在1h、2h时表达缓慢逐渐升高，在3h时达到高峰，comC、comE、comX基因分别升高10.54倍、7.24倍、3.28倍，4h之后表达减缓。通过3组变量的Pearson相关分析，comC基因与comX基因表达量的相关系数r=0.92，P＜0.05，comE与comX的相关系数r=0.748，P＜0.05，comC与comE的相关系数r=0.899，P＜0.05，提示3个变量呈显著正相关关系。 研究结论：①变形链球菌密度感应系统中CSP信号肽编码基因comC、胞内反应调控因子编码基因comE、RNA聚合酶编码基因comX均在外源性CSP信号肽诱导下的表达升高，在密度感应调控下游基因表达中发挥作用。②密度感应相关comC、comE、comX基因表达变化呈正相关关系，即变形链球菌密度感应系统呈现为正反馈自身调控。 第4章口腔变形链球菌密度感应T游基因表达调控的初步研究。 研究目的：实时定量检测变形链球菌基因转化相关基因cinA、严格应答相关基因relA的表达，从基因转录调控层面上认识密度感应对目的基因下游调控作用。方法：厌氧培养变形链球菌24h后，取出黏附菌膜的玻片置于新鲜TSB培养基中，加1μg/mlCSP信号肽，37℃厌氧培养0h，1h，2h，3h，4h，5h各时间点一步法提取总RNA，逆转录后，采用SYBRGreen1PCR对cinA、relA基因扩增，实时定量检测cinA、relA基因在不同时间段的表达情况。 研究结果：生物膜状态的口腔变形链球菌在加入密度感应CSP信号蛋白后，cinA基因的表达呈缓慢上升趋势，在加入CSP信号肽2h后，cinA的表达上升39.2％，3h后上升57.94％，5h后升高到原始表达量的2.03倍。relA的表达亦呈缓慢升高趋势，在0～3h内，relA的表达并无明显的变化，在4h时升高34.9％，5h时升高65.3％。 研究结论：生物膜状态口腔变形链球菌密度感应通过调节下游基因cinA、relA的表达，参与调控细菌的自然转化与严格应答。