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目的： 肿瘤疫苗(tumor vaccine)是指给机体直接或间接输入的具有抗原性的成分，它可刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫效应，用于治疗肿瘤。肿瘤细胞的抗原(antigen，Ag)绝大部分为细胞膜蛋白。收集其进行研究，对于寻找高效肿瘤抗原具有重要意义。本研究采用改良的Neville法和弱酸洗脱法收集不同分子量的人食管癌细胞株Eca-109细胞膜蛋白，寻找能引起免疫反应的肿瘤抗原，筛选出高效肿瘤抗原的大致范围，为食管癌的免疫治疗提供依据。 方法： 1．提取Eca-109细胞膜蛋白：使用改良的Neville法先提取细胞膜。然后在pH 6.3的条件下，用去垢剂(detergent)Triton Ⅹ-100和辛基β-葡糖苷(octyl β-glucoside)，把细胞膜上的蛋白溶解下来，以超滤法纯化膜蛋白并分组。 2．以超滤法纯化膜蛋白并分组：以超滤法将膜蛋白从以Triton Ⅹ-100作去垢剂的成分中按分子量大小分出＜3KD、3～10KD、＜10 KD、10～30 KD四个组；从以辛基β-葡糖苷做去垢剂的成分中分离出30～100 KD、＞100 KD两个组，并测定各组膜蛋白浓度。 3．测定膜蛋白的浓度：用Bradford检测法，在pH 6.3、波长595nm处，制作蛋白标准曲线，测定含有去垢剂的各组膜蛋白浓度，推导出适当的去垢剂与膜蛋白之比(即mg去垢剂／mg膜蛋白)。 4．检测Eca-109细胞的HLA表型及筛选健康志愿者：使用HLA引物试剂盒，琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)观察聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增后的DNA产物，鉴定出Eca-109细胞的HLA表型。采用血清学HLA分型技术，寻找至少有一个HLA Ⅰ类基因位点与Eca-109细胞HLA相匹配的健康志愿者。 5．人外周血DC的培养：取筛选出的志愿者的外周血，密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，用含粒细胞-巨噬郑州大学2004年博士学位论文人食管癌Eca一109细胞膜肿瘤杭原筛选的研究细胞集落刺激因子(granuloeyte一macro坤昭e eolo妙stimulati飞factor， GM一CSF)、白细胞介素一4(inierieukin一4，IL一4)及该志愿者血清的即Ml 1640培养液调整细胞密度后，加入24孔板中培养。于培养的第4天，根据一定比例加入膜蛋白，第6天加入LPS促进DC成熟，于第7天收获成熟的悬浮DC。 冷冻保存抗原负载的成熟DC:含有10%DMSO和5%葡萄糖的纯自身血清作为冻存液，可以将密度为10 xl护/ml抗原负载的成熟DC，以每分钟降温1℃，放置于液氮的气相中保存。 6.人外周血T细胞的培养:在IL一2维持下，流式细胞仪检测此志愿者PBMC的分化情况。根据检测结果，再收获PBMC，经过换培养瓶及PHA刺激，以含hIL一2的RPMI 1 640培养液常规培养PBMC4周，收集纯化的T细胞。 7.MTT法测定致敏T细胞的细胞毒活性:以纯化的T细胞为效应细胞，加入抗原负载的成熟DC，以8:l、16:l、32:l的效靶比分别加入Eea.1 09细胞(其为靶细胞);同时设阳性对照组、阴性对照组及效应对照组，各组设3个复孔，用MTT法在%孔板中测定CTL的细胞毒活性。 8.弱酸洗脱法:单层生长的Eca一109细胞每天按如下方法处理:去掉培养液，PBS洗三次，每瓶加5ml构椽酸一磷酸盐缓冲液(pH3.3)室温作用lmin，使MHC分子变性，释放MHC分子结合的肤入上清液。肿瘤细胞经PBS洗3次，用培养液继续培养。每瓶细胞最多酸洗3次弃去。含有肤的酸洗液经过seP一Pak C18柱脱盐、真空浓缩和Microeon YM·3(Millipore)超过滤，一ZooC冻存。 9.反相高效液相(RP一HPLC)分析:Eca一109细胞细胞膜酸洗肤用HPLC分离，流速lml/min，用O%~70%梯度(v八护)0.085%TEA的乙睛溶液(B液)洗脱，水相为含0.085%TFA的水溶液。手动收集各峰，脱盐、浓缩和干燥，一20℃冻存。 10.肿瘤特异性细胞毒性〔CTL)T淋巴细胞的体外诱导:取该志愿者负载不同组分抗原肤的DC作为刺激细胞，在刺激细胞培养孔中加入自身外周血淋巴细胞，于24h后，再加入等体积的含ZOU/m lth一IL一2继续培养，每3天换液1次。每7天应用刺激细胞重复刺激淋巴细胞1次，共培养21天。 11.”c:释放试验检测cTL杀伤活性:Eca一109细胞为靶细胞，在4 xl护细胞中加入100 p Ci Na25’CrO;，在室温中放置lh，不时摇动。用大量HankS液充分洗涤细胞3次，除去游离铬，配成5 x10勺m1肿瘤细胞悬液。细胞以50:1效靶细胞比加入96孔U一底培养板(200 pl/孔)培养4h。每个样品设置3个复孔，收集培养上清，用Y计数仪检测上清CPM值。含有淋巴细胞、不负载抗原DC和靶细胞的孔为对照孔。 结果:郑州大学2004年博士学位论文人食管癌Eca一109细胞膜肿瘤抗原筛选的研究 1.在pH 6.3的条件下，适当的去垢剂与膜蛋白之比(即mg去垢剂/mg膜蛋白)，在使用辛基p一葡糖昔时为6:1;使用肠妞。nX一100时为2:1。 2.Eea-log细胞的HLA的基因分型为A，03，A，24;B，35，B，37;n盼l’01，DRBI’12;DRB3。并找到一例表型为A03杂合子的健康志愿者。 3.PBMC的分化情况:健康人PBMC，只在IL一2维持下，用流式细胞仪检测其分化情况。B细胞于第1周时基本死亡，第3周时完全消失;NK细胞于第1周时明显增加，于第4周时