论文部分内容阅读
异丁醇是一种具有潜力的新型生物能源和平台化合物,并广泛应用于能源、食品、工业和医药等诸多领域。微生物发酵生产异丁醇受到人们的广泛关注,通过利用宿主菌自身的α-酮异戊酸合成途径和表达异源的Ehrlich途径,实现异丁醇的生物合成。本研究考察了地衣芽胞杆菌对异丁醇的耐受性,异源表达了Ehrlich途径,实现了地衣芽胞杆菌异丁醇的合成,并通过代谢途径改造提高了异丁醇的产量。在本研究中,通过添加不同浓度异丁醇(0%,0.4%,0.8%,1.2%,1.6%和2.0%)来比较地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和大肠杆菌对异丁醇的耐受性,根据菌株的相对生物量和存活率的结果表明,地衣芽胞杆菌对异丁醇的耐受性强于枯草芽胞杆菌和大肠杆菌,因此,地衣芽胞杆菌适合作为合成异丁醇的宿主菌株。地衣芽胞杆菌中不存在异丁醇合成途径,需要添加外源Ehrlich途径,才能实现异丁醇的合成。因此,本研究比较了三种不同来源的醇脱氢酶在地衣芽胞杆菌中催化异丁醛转化异丁醇的效果,结果显示,来源于大肠杆菌的yqhD编码的醇脱氢酶在地衣芽胞杆菌中转化异丁醛的效率最高。为提高其稳定性,将该基因整合到地衣芽胞杆菌染色体的噬菌体蛋白基因xkdI位点,获得重组菌DW2-01。在DW2-01上游离表达来源于乳酸乳球菌CICC 6246的编码酮酸脱羧酶的基因kivD,获得了重组菌株DW2-02。进行摇瓶发酵并检测异丁醇含量。结果表明,野生菌和DW2-01发酵液中均未检测到异丁醇,DW2-02菌株的异丁醇产量为550 mg/L,首次实现了异丁醇在地衣芽胞杆菌中的生物合成。二氢硫辛酸酰基转移酶(bkdB)能够将醛类转化成酰基辅酶A类物质,bkdB存在将会减少Ehrlich途径中间物异丁醛的积累,从而影响异丁醇的合成。本研究在B.licheniformis DW2-02基础上缺失bkdB,获得DW2-02ΔbkdB,进行摇瓶发酵。结果显示,DW2-02ΔbkdB菌株异丁醇产量可达964 mg/L,比DW2-02的异丁醇产量提高75.3%。表明敲除基因bkdB可以提高异丁醇的合成。敲除旁路途径,引导更多的碳代谢流流向异丁醇的合成,从而提高异丁醇的产量。在DW2-02ΔbkdB的基础上,分别敲除编码乙酰乳酸脱羧酶基因alsD、编码乳酸脱氢酶基因ldh和编码α-异丙基苹果酸合成酶基因leuA,以期减少乙偶姻、2,3-丁二醇,乳酸和亮氨酸的积累,获得系列工程菌株。发酵结果表明,尽管DW2-02ΔbkdB△alsD菌株的乙偶姻,2,3-丁二醇含量显著下降,但菌体生物量和葡萄糖消耗速率低于DW2-02ΔbkdB,而且其异丁醇的产量仅为523 mg/L,比DW2-02ΔbkdB异丁醇产量降低了45.7%。DW2-02ΔbkdBΔleuA菌株异丁醇的产量为843mg/L,低于DW2-02ΔbkdB菌株的产量。DW2-02ΔbkdBΔldh异丁醇的积累速率高于DW2-02ΔbkdB,其异丁醇的产量为1014 mg/L,比DW2-02ΔbkdB提高了5.2%。