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1.目的本实验目的之一旨在证明,肿瘤组织中只有一部分的肿瘤细胞才具有无限的增殖能力,它们才是肿瘤发生发展的关键,而其余的大部分肿瘤细胞只能进行相对有限的增殖和分化,仅起到维持肿瘤实体的作用。那部分具有巨大增殖潜能的肿瘤细胞称之为肿瘤干细胞,肿瘤的生长和致瘤能力主要是由于肿瘤干细胞的分裂、增殖所致;目的之二则是证明ATRA协同BCNU比单独应用BCNU对人脑肿瘤干细胞的靶向抑制效应更大,以及探讨在此过程中的细胞与分子生物学机制,从而为诱导分化剂和细胞毒性化疗药物在神经外科临床中联合应用治疗较高级别胶质瘤提供相应的体外实验基础。第一章利用从34例较高级别星型细胞胶质瘤中分离培养具有异常增殖能力的人脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell,BTSC),通过分离、培养、纯化、鉴定BTSC以及裸鼠脑内移植BTSC致瘤等一系列实验获得可靠的BTSC细胞株。观察BTSC的原代接种培养与连续传代和体外增殖特性以及BTSC的自我更新及多向分化能力;利用免疫磁珠法分离CD133阳性和阴性细胞以纯化BTSC以及用CD133阳性和阴性细胞分别脑内移植接种BALB/c-nu裸鼠致瘤实验验证BTSC致瘤能力;通过BTSC在含血清培养基中贴壁分化后,再次转入无血清培养条件下的去分化观察BTSC是否存在去分化现象。第二章的是探讨体外ATRA协同BCNU靶向抑制BTSC的细胞和分子生物学机制。通过单克隆形成实验和MTT实验观察ATRA协同BCNU在体外是否抑制BTSC的增殖;利用AO/EB双荧光染色法观察ATRA协同BCNU体外抑制BTSC过程中是否有凋亡的发生并利用流式细胞术定量检测凋亡比例;通过RT-PCR实验探讨Survivin基因的改变是否为ATRA协同BCNU促BTSC凋亡的分子机制之一。2.方法第一章中主要利用添加了表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养基和悬浮培养模式,分离培养34例较高级别星型细胞胶质瘤中的BTSC;通过BTSC的BrdU掺入实验以及其在含血清培养基中贴壁分化实验鉴定BTSC的自我更新及多向分化能力;利用免疫磁珠法分离CD133阳性和阴性细胞以纯化BTSC以及用CD133阳性和阴性细胞分别脑内移植接种BALB/c-nu裸鼠致瘤实验验证BTSC的致瘤能力;通过BTSC在含血清培养基中贴壁分化后,再次转入无血清培养条件下的去分化观察BTSC的去分化特性。第二章主要通过单克隆形成实验和MTT实验观察ATRA协同BCNU在体外抑制BTSC的增殖;利用AO/EB双荧光染色法定性观察ATRA协同BCNU体外抑制BTSC过程中的凋亡现象并利用流式细胞术定量测定了凋亡比例;通过半定量RT-PCR实验研究ATRA协同BCNU促BTSC凋亡的分子机制,在上述实验中均设置对照组并做统计学分析。3.结果第一章结果表明,利用本研究使用的培养方法可以从本组全部34例较高级别星型细胞胶质瘤病例中分离培养出BTSC;BTSC具有无限扩增和自我更新能力,表达CD133和Nestin;在撤除生长因子并添加胎牛血清的培养环境中BTSC发生贴壁分化,分化肿瘤细胞可以具有神经元(NeuN)、星形胶质细胞(GFAP)、少突胶质细胞(CNPase)的表型,即BTSC具有多向分化能力;利用免疫磁珠细胞分离技术可以获得纯度很高的、具有体外增殖和体内致瘤能力的BTSC,可以在裸鼠脑内导致肿瘤发生;BTSC在含血清培养基中贴壁分化后,再次转入无血清培养条件下具有去分化特性。第二章结果表明,ATRA协同BCNU在体外较单独应用BCNU更能抑制BTSC的增殖,削弱BTSC的自我更新能力;在ATRA协同BCNU体外抑制BTSC过程中有凋亡现象,凋亡比例比单独应用BCNU有显著提高;通过半定量RT-PCR实验证实ATRA协同BCNU促BTSC凋亡的分子机制之一为Survivin基因的下调。4.结论胶质瘤的肿瘤组织中存在具有无限扩增能力的BTSC;可以利用添加EGF和bFGF的无血清培养基和悬浮细胞培养方法成功分离培养BTSC;BTSC可以在这种体外培养环境中增殖形成单克隆性脑肿瘤干细胞球;BTSC可以分化产生具有多种成熟神经细胞表型的分化肿瘤细胞;可以初步确定CD133为BTSC的特异性标志物;BTSC可以在裸鼠脑内导致肿瘤发生;BTSC具有去分化特性。ATRA协同BCNU在体外较单独应用BCNU更能抑制BTSC的增殖以及削弱BTSC的自我更新能力;在ATRA协同BCNU体外抑制BTSC过程中存在凋亡,凋亡比例比单独应用BCNU有显著提高,其分子机制之一为Survivin基因的下调。本实验首次在体外实验中证实ATRA协同BCNU比单独应用BCNU对人脑肿瘤干细胞的靶向抑制效应更大,从而为诱导分化剂和细胞毒性化疗药物在神经外科临床中联合应用治疗较高级别胶质瘤提供了相应的理论和实验基础。