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含马兜铃酸中药的安全性是社会广泛关注的热点问题,虽然一些含AA-I含量高的品种如关木通、广防己、青木香等已经禁止使用,但仍有些马兜铃科中药如细辛还在临床使用。社会上一直有将所有马兜铃科中药禁用的呼声,但由于目前缺乏深入、系统和全面的研究,相关品种禁用与否缺乏充分的科学依据,这使得相关品种的临床使用和药品监管面临极大的挑战。迄今,已发现的AAs有约170种,不同马兜铃科中药所含的AAs种类和含量各异,如马兜铃中马兜铃酸Ⅰ（AA-I）的含量很高,而细辛中AA-I的含量极低或检测不出,但其主要含马兜铃酸Ⅳa（AA-Ⅳa）。以往关于AAs的毒性研究主要聚焦于AA-Ⅰ,已经证明AA-Ⅰ可引起急性肾毒性、慢性肾间质纤维化,然而AA-Ⅳa是否如AA-Ⅰ一样具有潜在的肾脏毒性,尤其是引起肾间质纤维化,目前缺乏研究。细辛是一种临床广泛使用的中药,也是2020版《中国药典》中唯一收录的马兜铃科中药。据统计,含细辛的中药制剂约有200种,其中很多制剂极为常用,不乏儿童常用药。阐明AA-Ⅳa的安全性问题对于主要含AA-Ⅳa的中药,如细辛的临床安全使用及药品监管具有极其重要的科学价值和意义。目的:通过AA-Ⅳa与AA-Ⅰ平行比较的短期和长期用药的毒性研究,明确AA-Ⅳa是否具有潜在的肾脏毒性,尤其是是否可能引起肾间质纤维化,客观评价AA-Ⅳa的安全性。阐明AA-Ⅳa与AA-Ⅰ的毒性差异,并通过蛋白组学研究阐明二者肾毒性差异的机理,为含AA-Ⅳa中药的临床安全使用和药品监管提供科学依据。方法:1.细辛等4种常用马兜铃科中药中AAs种类和含量的分析本研究采用高效液相色谱定量分析了 4种常用马兜铃科中药中AA-Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ（AA-Ⅱ）、马兜铃酸Ⅲa（AA-Ⅲa）、AA-Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ（AL-Ⅰ）的含量,包括马兜铃（19批）、天仙藤（17批）、细辛（15批）和朱砂莲（15批）。以 Agilent Eclipse XDB C18 色谱柱（4.6×150 mm,5 μm）进行分离,以乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min。以外标法对上述5种马兜铃酸类物质进行定量分析,检测波长为254 nm。2.AA-Ⅰ与AA-Ⅳa的肾毒性差异研究（1）AA-Ⅰ与AA-Ⅳa的体外毒性比较:不同浓度的AA-Ⅰ和AA-Ⅳa分别处理HK2细胞24 h和48 h后,用CCK-8试剂检测AA-Ⅰ和AA-Ⅳa对HK2细胞的半数抑制浓度IC50值。选用不同的荧光探针,通过高内涵筛选系统考察AA-Ⅰ、AA-Ⅳa对HK2细胞线粒体功能（线粒体膜电位MMP,线粒体质量）、细胞内钙离子浓度及凋亡的影响。（2）AA-Ⅰ与AA-Ⅳa单次灌胃给药的肾毒性比较:选用ICR小鼠70只,随机分为7组,每组10只,雌、雄各半,分别为对照组、AA-Ⅰ不同剂量组（10、20、40 mg/kg）,AA-Ⅳa不同剂量组（10、20、40 mg/kg）。单次灌胃给药后,连续14天内观察各组动物的死亡情况。观察期结束后,经眼静脉丛取血,检测肾功能生化指标（BUN、CRE）。摘除肾脏组织,进行病理学检查。（3）AA-Ⅰ与AA-Ⅳa诱导DNA损伤的活性比较:选用ICR雄性小鼠20只,随机分为4组,每组5只,分别为对照组、甲磺酸乙酯组（EMS）、AA-Ⅰ 20mg/kg剂量组和AA-Ⅳa20 mg/kg剂量组。灌胃给药,每日一次,连续3天,末次给药2 h后,提取小鼠肾原代细胞,采用彗星电泳实验检测AA-Ⅰ和AA-Ⅳa对DNA的损伤。（4）AA-Ⅰ与AA-Ⅳa长期灌胃给药的肾毒性比较:选用C57雄性小鼠190只,随机分为6组,分别为对照组、AA-Ⅰ不同剂量组（0.1、1、10 mg/kg）、AA-Ⅳa不同剂量组（1、10 mg/kg）。除了 AA-Ⅰ 10mg/kg剂量组动物为40只外,其他组均为30只。每周灌胃给药3次（周一、三、五）,连续给药22W,停药后继续观察50W。每日观察动物的一般状况,记录死亡情况、每周体重和摄食量。分别于给药22W、停药29W及停药50W时处死部分小鼠,取血解剖,检测生化指标（BUN、CRE）、脏器重量及系数,脏器病理,肾脏切片的马松染色,评价AA-Ⅰ与AA-Ⅳa的肾脏毒性,明确AA-Ⅳa是否引起肾间质纤维化。3.AA-Ⅰ与AA-Ⅳa肾毒性机理研究（1）AA-Ⅰ诱导肾间质纤维化的关键靶点及信号通路筛选与验证:收集AA-Ⅰ（10 mg/kg）长期给药22W的肾脏组织和对照组的肾脏组织,进行TMT和磷酸化蛋白质组学研究,经蛋白提取-蛋白质检-蛋白前处理（酶切、除盐）-TMT标记多肽-磷酸化富集多肽-液质检测等步骤得到原始数据。数据经处理后得到差异表达蛋白,AA-Ⅰ组和对照组之间差异蛋白质应满足以下条件(P＜0.05,|log2FC|＞*（FC＞*or FC＜*[fold change,FC]）。对差异表达蛋白质进行基因本体论（GO）注释,总结相关蛋白质的分子功能和生物学过程,并进行KEGG通路富集分析。对差异表达蛋白进行火山图分析、聚类热图分析。对磷酸化蛋白的激酶进行预测分析,通过NetworkIN 3.0计算模型,构建蛋白与激酶之间的相互作用网络,找到磷酸化修饰位点对应的激酶家族,进一步确定底物与激酶之间的关系。通过WB实验验证筛选到的关键靶点及信号通路,通过抑制剂实验验证激酶与底物之间的关系。此外,我们构建了 STAT3干扰小RNA、STAT3过表达质粒、S100A11启动子野生型荧光素酶质粒及内参质粒,将其共转入HK2细胞中,通过荧光素酶报告基因验证转录因子STAT3与目的基因的关系。（2）AA-Ⅰ与AA-Ⅳa对关键靶点及信号通路的影响差异:通过WB实验检测AA-Ⅳa（10 mg/kg）给药22W后对小鼠肾脏组织中上述AA-Ⅰ（10 mg/kg）激活的关键靶点及信号通路的影响,考察AA-Ⅰ和AA-Ⅳa肾毒性差异的机制。结果:1.细辛等4种常用马兜铃科中药中AAs种类和含量的分析4种常用马兜铃科中药中AAs的种类和含量差异很大,其中马兜铃和天仙藤含有 5 种 AAs（AA-Ⅰ、AA-Ⅱ、AA-Ⅲa、AA-Ⅳa 和 AL-Ⅰ）,朱砂莲含有 4 种 AAs（AA-Ⅰ、AA-Ⅱ、AA-Ⅲa 和 AA-Ⅳa）,细辛仅含量 2 种 AAs（AA-Ⅳa 和 AL-Ⅰ）。马兜铃和朱砂莲中AA-Ⅰ的含量较高,分别达到0.5 mg/g和3.7 mg/g生药的水平,天仙藤中AA-Ⅰ的含量很低,仅在0.02 mg/g生药的水平,细辛中几乎未检测到AA-Ⅰ和AA-Ⅱ,但细辛和天仙藤中AA-Ⅳa的含量较高,分别达到0.1 mg/g和0.26 mg/g生药的水平。可见,细辛和天仙藤中的AAs以AA-Ⅳa为主,而已知有毒的AA-Ⅰ的水平微乎其微。2.AA-Ⅰ与AA-Ⅳa的肾毒性比较（1）AA-Ⅰ和AA-Ⅳa的体外毒性比较:AA-Ⅰ和AA-Ⅳa处理HK2细胞24 h后,其IC50值分别是251μM和＞1000 μM,当处理时间延长至48 h,AA-Ⅰ的IC50值降到了 82.99 μM,而AA-Ⅳa的IC50值仍高于1000 μM。AA-Ⅰ引起HK2细胞数量减少,线粒体膜电位增加,钙离子浓度增加以及细胞凋亡增加,提示AA-Ⅰ的细胞毒性较大,可能通过影响线粒体功能诱导细胞凋亡。而AA-Ⅳa对上述指标影响较小,提示AA-Ⅳa对线粒体功能及凋亡的影响较小,其细胞毒性较小。（2）AA-Ⅰ与AA-Ⅳa单次灌胃给药的肾毒性比较:AA-1 40mg/kg单次灌胃给药后第5天开始陆续出现动物死亡,14天观察期内10只动物有7只死亡（♂:4,♀:3）。AA-I 20、I0 mg/kg剂量组未见动物死亡。AA-I 20mg/kg剂量组雄性小鼠的BUN和CRE水平较对照组显著升高（P＜0.05）,而雌性小鼠肾功能未见异常;10mg/kg剂量组的雌、雄小鼠的上述指标未见异常。病理检查发现AA-Ⅰ组小鼠的肾脏组织损伤明显,包括部分肾小管坏死、上皮细胞肿胀、脱落等。AA-Ⅳa 3个剂量组均未见动物死亡,血清BUN、CRE水平与对照组相比未见明显差异,肾脏病理检查未发现异常。结果表明AA-IVa单次给药无明显肾脏毒性,而AA-Ⅰ可引起急性肾损伤及动物死亡。（3）AA-Ⅰ与AA-Ⅳa诱导DNA损伤的活性比较:小鼠灌胃给予20 mg/kg的AA-I 3次后,提取肾原代细胞进行彗星电泳。结果显示AA-Ⅰ组肾细胞有明显的拖尾现象,与对照组相比尾矩及DNA百分含量著增加,说明AA-Ⅰ引起了肾细胞的DNA损伤。相同剂量的AA-Ⅳa灌胃给药3次后,上述指标与对照组相比无明显差异,提示AA-Ⅳa未引起肾细胞的DNA损伤。（4）AA-Ⅰ与AA-Ⅳa长期灌胃给药的肾毒性比较:AA-Ⅰ（10、1 mg/kg）长期给药出现明显的毒性反应,实验期间有大量动物死亡,其中10 mg/kg剂量组开始于给药10W,1 mg/kg剂量开始于停药21W。AA-Ⅰ的肾脏毒性非常明显,血清BUN和CRE较对照组显著增加,肾脏组织病理检查可见弥漫性的纤维化、肾小管上皮细胞萎缩和管腔扩张。停药后上述病变未见减轻和逆转。结果表明AA-Ⅰ可引起严重的肾毒性,并且肾损伤不可逆。在给药22W,停药29W、50W时,AA-Ⅳa 10、1 mg/kg剂量组未见动物死亡,肾功能指标BUN、CRE与对照组相比无明显差异,肾脏组织病理检查未见明显病变,马松染色未观察到明显的肾间质纤维化,提示AA-Ⅳa长期给药未引起明显的肾脏毒性。以上结果提示,AA-Ⅳa与AA-Ⅰ具有明显的毒性差异,AA-Ⅳa的肾脏毒性不明显。3.AA-Ⅰ与AA-Ⅳa的肾毒性差异机制根据上述AA-Ⅰ与AA-Ⅳa肾毒性差异的研究,AA-Ⅰ引起了明显的肾毒性,尤其是肾间质纤维化,而AA-Ⅳa未见明显肾毒性。因此,我们对AA-Ⅰ诱导的肾间质纤维化的关键靶点及信号通路进行了研究。在此基础上,进一步研究AA-Ⅳa对肾间质纤维化的关键靶点和信号通路的影响,阐明AA-Ⅳa与AA-Ⅰ肾毒性差异的机制。（1）AA-Ⅰ诱导肾间质纤维化的关键靶点及信号通路筛选与验证:采用TMT和磷酸化蛋白质组学进行研究,我们对6,475个蛋白进行了定量,其中有4,420个蛋白发生了磷酸化修饰,这些磷酸化修饰对应14,500个磷酸化事件。蛋白质组数据分析表明,AA-Ⅰ给药组中共有984个差异蛋白,其中有580个上调和404个下调蛋白。而AA-Ⅰ引起1,933个磷酸化蛋白发生显著改变,其中1,490个磷酸化蛋白显著上调,443个磷酸化蛋白显著下调。蛋白质组结果显示,AA-Ⅰ诱导的肾间质纤维化小鼠中有很多代谢途径发生显著下调,AA-Ⅰ同时也激活了某些信号,包括细胞外基质相关通路、PI3K-AKT信号通路、粘着斑、癌症等相关通路。磷酸化蛋白质组结果显示,AA-Ⅰ诱导的肾间质纤维化小鼠中有很多相似的代谢途径被抑制,但是其激活的信号与TMT蛋白质组有所不同,主要包括MAPK信号、mTOR信号、肿瘤坏死因子（TNF signaling）和Ras信号。我们发现AA-Ⅰ诱导的肾间质纤维化小鼠中磷酸化蛋白对应的激酶数量高于对照组小鼠,提示磷酸化在AA-Ⅰ诱导的肾间质纤维化的发生、发展过程中有重要作用,AA-Ⅰ可能通过激活MAPK信号通路促进肾间质纤维化的发生、发展。抑制剂实验结果表明,STAT3可能是p38MAPK激酶的底物。我们通过WB实验验证了 10 mg/kg的AA-Ⅰ给药22W后,小鼠肾脏组织中p38MAPK-STAT3信号被激活,并通过双荧光素酶报告基因实验证实了 STAT3能调控S100A11的转录表达。因此,发现p38MAPK-STAT3-S100A11信号轴的激活参与了 AA-Ⅰ诱导的肾间质纤维化。同时发现 Bad、α-SMA、TGFβ、BAG3、Bcl-xL、MMP2 等 STAT3 的潜在靶蛋白在AA-Ⅰ10 mg/kg剂量组中显著上调,这些蛋白水平的异常改变可能与AA-Ⅰ诱导的肾间质纤维化和肿瘤有关。（2）AA-Ⅰ与AA-Ⅳa对关键靶点及信号通路的影响差异:相同剂量的AA-Ⅳa给药22W仅能激活p38MAPK信号,对STAT3信号无明显影响,可能无法调控STAT3下游的靶基因。此外,Bad、α-SMA等在AA-Ⅰ（10 mg/kg）组小鼠中显著上调的蛋白在AA-Ⅳa（10 mg/kg）组中未发生显著改变。提示AA-Ⅳa与AA-Ⅰ对p38MAPK-STAT3-S100A11信号通路、Bad、α-SMA等关键蛋白调控的差异可能是AA-Ⅰ与AA-Ⅳa肾毒性差异的原因。结论:1.马兜铃科中药品种不同所含的AAs种类不同,细辛基本不含AA-Ⅰ、AA-Ⅱ,但含有较高的AA-Ⅳa,天仙藤也含有较高的AA-Ⅳa。2.AA-Ⅰ可引起严重的肾毒性,高剂量单次用药可引起急性肾毒性和死亡,即使是较低剂量长期给药也可以引起肾间质纤维化;AA-Ⅳa单次给药及长期给药均未见明显的肾脏毒性。3.AA-Ⅰ诱导的肾间质纤维化可能与p38MAPK-STAT3-S100A11信号的激活及TGFβ、α-SMA、Bad表达增加有关,而AA-Ⅳa虽然能激活p38MAPK,但是对STAT3及其潜在靶点S100A11、α-SMA、Bad的调控并不显著,提示STAT3的激活与否可能是引起AA-Ⅰ与AA-Ⅳa肾毒性差异的原因。4.AAs种类不同而毒性各异,含AAs中药的毒性不能一概而论,应客观认识和科学对待。细辛基本不含AA-Ⅰ、AA-Ⅱ,而主要含AA-Ⅳa,其肾脏毒性风险可能较低。5.本研究以科学证据揭示了 AA-Ⅳa与AA-Ⅰ的毒性完全不同,由此我们首次提出“AAs种类不同毒性各异,并非所有AAs都有肾毒性,含AAs中药的毒性不能一概而论”的学术观点。