研究背景随着人民生活水平的提高,饮食结构及生活作息不良所导致的肥胖、骨质疏松等亚健康状态日趋严重,II型糖尿病、胰岛素抵抗等疾病的发病率亦呈逐年升高的趋势,且患者一旦患病往往需要终生服药,影响生活质量。研究发现在这些病理条件下,人体内会产生大量脂肪组织,在骨髓腔中也可观察到大量脂肪细胞蓄积,使髓腔呈现黄色。脂肪细胞在髓腔中的蓄积会抑制成骨细胞增殖、分化和功能,对骨组织的代谢产生非常严重的影响。虽然成骨细胞增殖分化相关的重要分子序贯发生的框架已经建立完成,但是脂肪细胞对成骨细胞产生脂毒性的具体分子生物学机制却仍未明确。游离脂肪酸(Free fatty acids,FFAs)可以对多种细胞的活性起到抑制作用。脂肪细胞通过脂解作用,将胞内的脂滴分解成游离脂肪酸,在大部分情况下,游离脂肪酸含量的异常升高会通过线粒体脂肪酸β氧化作用产生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),而活性氧的产生又可以进一步激活下游信号通路级联反应,从而对细胞凋亡、增殖、分化产生影响。因此游离脂肪酸的含量将直接影响细胞的生物学活性。地塞米松是一个广泛应用于临床的糖皮质激素类药物,长期大剂量使用会导致严重的骨质疏松甚至骨坏死,文献报道地塞米松可以促进脂肪细胞脂解作用从而增加游离脂肪酸的含量。二甲双胍可以延缓胃肠道对葡萄糖的吸收速率,提高胰岛素的敏感性,抑制肝的糖异生。对于非胰岛素依赖性糖尿病有非常好的治疗效果,同时可以降低体脂含量。研究发现二甲双胍可以抑制脂肪细胞脂解从而减少游离脂肪酸的含量。mapks信号转导通路(mitogen-activatedproteinkinases,mapks)是存在于细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在大多数细胞内均检测到mapks信号转导通路,该信号通路在将细胞外刺激级联传递至细胞及核内,并引起细胞生物学反应如增殖、分化、凋亡等的过程中具有至关重要的作用。mapks信号通路在骨形成过程中起到关键的作用,但由于所处上游可以干扰几乎与骨形成所有相关的分子通路(如ihh-pthrp、bmp、wnt-β-catenin、egf、fgf),因此在不同外界因素的刺激下可导致促进或抑制骨形成两种截然不同的结果出现。ros可以激活细胞内mapks信号通路。研究目的①探讨脂肪细胞对成骨细胞增殖、分化的影响,建立脂肪细胞/成骨细胞共培养体系;探索不同浓度地塞米松、二甲双胍对成骨细胞增殖、分化,脂肪细胞成脂、分化的影响,为后期实验选择合适剂量浓度;②分析共培养体系中氧化应激水平的变化,探讨氧化应激水平与游离脂肪酸两者间的关系;游离脂肪酸含量测定以及地塞米松、二甲双胍对游离脂肪酸含量的影响;③探讨共培养体系下对成骨细胞生物学活性影响的主要分子机制。方法与结果①首先建立成脂细胞、成骨细胞共培养体系,为后期实验建立合适的实验模型。选用3t3-l1小鼠前成脂细胞系和mc3t3-e1小鼠前成骨细胞系,两细胞系分别进行成脂诱导和成骨诱导12天后,通过qrt-pcr分别对成脂相关基因ppar-γ、adiponectin、fabp以及成骨相关基因runx2、cola1、osteocalcin进行测定,并行染色学鉴定确定两细胞系均已分化为成熟的脂肪细胞和成骨细胞,用于共培养及后续实验。②在共培养体系下测定成骨细胞增殖及分化能力的改变。发现adipocyte/osteoblast(ad/ob)共培养组,成骨细胞凋亡较对照组明显增加,且在早期ad/ob组较ob/ob组细胞增殖能力受到抑制,后期ad/ob组成骨能力也明显减弱。提示脂肪细胞可以抑制成骨细胞的生物学活性。③进一步研究发现,共培养体系ad/ob组ffas较ob/ob组有明显增加,pai-1、mcp-1、leptin、adiponectin、il-6含量较ob/ob组变化不明显,无统计学差异。④地塞米松、二甲双胍可以分别作用于脂肪细胞和成骨细胞,对两细胞的增殖及分化产生影响,且存在剂量依赖关系。共培养体系下发现ffas含量可以受到地塞米松和二甲双胍的影响,地塞米松可以促进ffas含量的升高,二甲双胍可以抑制ffas生成,且均存在剂量依赖关系。同时两药物还对pai-1、mcp-1、leptin、adiponectin、il-6含量起到一定影响,但无统计学意义。⑤在共培养体系中分别加入ffas、地塞米松、二甲双胍,通过改变ffas含量发现对mc3t3-e1凋亡、增殖及成骨分化能力有明显影响。提示ffas在脂肪细胞对成骨细胞的影响中扮演重要角色。⑥为了分析共培养体系下氧化应激水平的变化,检测mda、sod活性、gsh-px活性、ros含量,发现ad/ob组抗氧化水平明显降低,而ros含量明显增高。单纯添加ffas、地塞米松后可以提高ros含量,而二甲双胍可以降低ros的含量。添加ros抑制剂nac后,可以改善ad/ob组成骨细胞增殖及成骨分化能力。考虑是由于ffas提高成骨细胞氧化应激水平,从而进一步影响其细胞活性。⑦westerblot检测发现,ad/ob组akt、erk、p38磷酸化水平明显升高,在分别添加ffas和地塞米松后将进一步提高akt、erk、p38磷酸化水平,而加入二甲双胍后可以抑制三者磷酸化水平的升高,并可以抑制地塞米松的作用。这一结果表明ffas可以通过akt、erk、p38信号通路的改变来影响成骨细胞活性。⑧通过应用ly294002(akt信号通路抑制剂)、sb203580(p38信号通路抑制剂)、pd98059(erk信号通路抑制剂)发现,抑制erk和p38信号通路可以明显降低共培养体系下脂肪细胞抑制成骨细胞增殖、分化的毒性作用。共培养体系中加入nac后,观察到akt、erk、p38磷酸化水平发生明显的抑制。提示脂肪细胞在ad/ob共培养体系下是通过ffas-ros-p38/erk通路对成骨细胞增殖、分化起到抑制作用。研究结论通过本课题的研究,我们发现共培养体系下脂肪细胞对成骨细胞凋亡、增殖、分化起抑制作用,阐明了该过程的分子机制,明确了FFAs-ROS-Erk/P38信号通路在这一过程中的调控作用,为进一步认识、研究肥胖与骨质疏松间的关系奠定了理论基础。同时在实验组发现地塞米松对脂毒性的促进作用,为糖皮质激素性骨质疏松的病因及机制提供了新的认识;二甲双胍的保护作用,为治疗糖皮质激素性骨质疏松的治疗提供新的思路。