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目的:构建包含p53基因的真核细胞表达重组质粒,观察肝癌细胞株HepG2中p53过表达与否对细胞生长的影响,研究HepG2细胞在生长环境压力下p53蛋白对细胞的保护作用。方法:构建真核表达质粒pcDNA-GFP-p53和pc DNA-ND1,分别转染、筛选得到基因过表达细胞株。免疫荧光、DAB染色观察环境压力下p53蛋白亚细胞定位的变化。采用四种方法研究p53蛋白对HepG2细胞的保护作用:细胞凋亡染色后进行流式荧光分选;RT-qPCR相对定量方法检测自噬相关基因BECN1和MAPLC3相对转录水平;软琼脂克隆形成实验观察细胞集落形成情况;WST-8法测定多柔比星作用下细胞的增殖活力。RT-qPCR和Western Blot检测p53蛋白对线粒体基因mtND1的调节。运用流式荧光分选凋亡细胞、RT-qPCR检测自噬相关基因转录以及线粒体膜电位染色研究mtNDl过量表达对细胞的影响。结果:1、成功构建pcDNA-GFP-p53和pcDNA-ND1真核表达重组质粒,通过G418筛选获得稳定转染细胞株HepG2-p53和HepG2-ND1。2、细胞免疫荧光观察发现HepG2-p53细胞在环境压力(H2O2氧化应激、饥饿)下,p53蛋白的亚细胞定位会发生从细胞核转向细胞质的变化。3、与正常培养相比,环境压力下p53过表达使细胞拮抗凋亡发生,诱发自噬基因BECN1和MAPLC3转录水平上升,维持细胞在软琼脂培养基上的克隆形成能力,降低细胞对多柔比星的敏感性,Pft-α处理细胞后反向调节以上结果。4、mtND1基因上存在p53蛋白特异性结合的DNA序列。纯化的p53蛋白与mtND1基因体外孵育后,引起后者在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率下降。5、p53蛋白对mtND1基因的转录和表达水平在正常环境下和压力环境下呈现双向调控状态。mtNDl过表达引起HepG2细胞凋亡程度增加,自噬基因BECN1和MAPLC3转录水平受到抑制,线粒体膜电位流失。结论:与p53传统的抗癌作用机制不同,我们发现HepG2细胞中野生型p53基因的过量表达,有助于癌细胞在氧化应激、饥饿、抗癌药物刺激等环境压力下,拮抗凋亡发生。p53对细胞的这种保护作用与对线粒体基因mtND1的负调控有关,该基因的过量表达使细胞中线粒体膜电位下降明显,并更易发生凋亡。