第一部分树突状细胞在NCPP抗肿瘤中的作用目的短小棒状杆菌(CP)制剂是一种非特异性免疫增强剂。大量临床资料显示，CP制剂在治疗癌性胸水、局部注射治疗黑色素瘤、抗病毒、细菌感染以及在治疗免疫功能低下性疾病方面已取得令人兴奋的进展，但副作用较大限制了其进一步的临床应用。若能利用先进技术制备出疗效好、副作用低、应用范围广的新型制剂，必将有着重要的应用价值。无细胞短棒状杆菌制剂(Non-cell Corynebacterium Parvum Product，NCPP)是利用纳米技术制备出的一种新型免疫调节剂。树突状细胞(dendritic cell，DC)是岂今为止人们所发现的体内功能最强的抗原提呈细胞，同时也是可以在体内外直接激活机体初始和特异性免疫应答的唯一细胞。研究表明，DC可以有效地摄取肿瘤抗原，加工处理成抗原肽，然后递呈给效应性T淋巴细胞，发挥特异性的抗肿瘤作用。我们在前期工作中已经证明了NCPP可以激活机体的巨噬细胞(Macrophage，Mφ)，发挥抗肿瘤作用。如果NCPP亦能够激活机体的DC，那么这将对NCPP抗肿瘤免疫的深入研究起着重要的作用。因此，本论文旨在研究荷瘤小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived DCs，BMDCs)在NCPP抗肿瘤中的作用，对NCPP抗肿瘤免疫机制进行了深入探讨。方法1．NCPP抗肿瘤活性及脾激活作用的检测将B16黑色素瘤细胞悬液接种于C57BL／6鼠。待肿瘤长至5mm×5mm，将小鼠随机分为B16／NCPP组、B16／CP组、B16／PBS组及PBS组。治疗组腹腔注射NCPP或CP鼠；对照组注射PBS，同时开始测量肿瘤大小，纪录各组小鼠的生存时间，计算生存率，并于注射NCPP或CP后第14天处死小鼠，称量瘤重及体重，评价NCPP的抗肿瘤活性。另将BALB／c小鼠随机分为3组(NCPP组、CP组及PBS对照组，6只／组)，腹腔注射NCPP或CP，对照组注射等体积的PBS。注射后第14天处死小鼠，分别称体重、脾重、计算脾指数。2．NCPP给药后荷瘤小鼠骨髓细胞中DC及Mφ数量的检测NCPP治疗后第14天，制备荷瘤小鼠骨髓细胞悬液，裂解红细胞后用PBS调浓度为1×10~7／ml，FITC-CD11c，PE-MHC-ⅡmAb和PE-F4／80 mAb流式抗体4℃避光标记30分钟，PBS洗两次，流式细胞仪检测各类细胞的比例。3．荷瘤小鼠BMDCs的诱导及鉴定各组骨髓细胞以相同的数量种板，诱导培养至第9天，收集各组细胞，调浓度为1×10~6／ml，FITC-CD11c mAb，PE-MHC-ⅡmAb标记，流式检测各组BMDCs的诱导情况。剩余细胞种24孔板(5×10~5／ml)，同时加入LPS(10ug／ml)，37℃，5％CO2孵箱中培养48小时后，收集各组细胞，FITC-CD80 mAb抗体4℃避光标记30分钟，PBS洗两次，流式细胞仪检测各组细胞CD80的表达情况。4．荷瘤小鼠BMDCs抗原递呈功能检测简言之，将不同组BMDCs种96孔板(1×10~5／ml／100ul)，同时加入LPS(10ug／ml)，37℃，5％CO2孵箱中培养48小时，加入CD8+T细胞磁珠分选正常C57BL／6小鼠脾脏得到的纯化CD8+T细胞，使得CD8+T与BMDCs的比例为20：1，培养体系内再加入状态良好的B16黑色素瘤细胞，终浓度为5×10~4／ml。共培养48小时后，应用CCK-8试剂盒检测不同组BMDCs的抗原递呈功能。结果1．NCPP抗肿瘤效应及脾激活作用各组荷瘤鼠肿瘤大小的测量结果显示，与对照组相比，从注射NCPP或CP后第11天起，B16／NCPP和B16／CP组小鼠黑色素瘤生长速度明显减慢，同一时间点肿瘤体积明显减小(P＜0.01)，但是NCPP和CP组之间没有显著性差异(P＞0.05)。脾激活实验的测定结果显示，NCPP和CP组小鼠脾激活明显，脾指数的值与对照组比有统计学意义(P＜0.05)，表明NCPP具有与CP相似的抗肿瘤活性和脾激活效应。2．NCPP给药后荷瘤小鼠骨髓DCs和Mφ的数量变化流式检测结果显示，B16／PBS组小鼠骨髓DCs的阳性率为1.25±0.53％，B16／NCPP和B16／CP分别为2.65±0.38％和3.15±0.25％，表明，与B16／PBS组相比，NCPP或CP处理显著增加了小鼠骨髓DCs和Mφ的水平(P＜0.05)。3．NCPP给药促进了荷瘤鼠成熟DCs协同刺激分子的表达流式检测结果表明，B16／PBS组DCs的阳性率为36.5±1.69％，而B16／NCPP组和B16／CP组BMDCs的阳性率为分别为59.4±0.49％和51.3±4.03％，表明，与B16／PBS组相比，NCPP或CP处理抵抗了肿瘤对髓系前体细胞的抑制效应(P＜0.05)。加入LPS体外培养48小时，收集细胞的流式结果亦显示，与B16／PBS组相比，B16／NCPP组BMDCs的成熟程度明显增加，表面分子CD80的表达率由71％上升到96.2％。4．NCPP给药促进了荷瘤鼠成熟DCs的抗原递呈能力各组荷瘤小鼠DCs的抗原递呈功能的检测结果表明：在培养的第9天，各组未成熟BMDCs对CD8+T细胞杀瘤效应无明显影响。加入LPS刺激培养48小时后，与B16／PBS组相比，B16／NCPP组DCs可明显增加CD8+T细胞的杀瘤效应，CD8+T细胞的杀伤效率由47.9±2.3％上升到54.2±2.4％。表明，B16／NCPP组DCs的抗原递呈功能明显增强(P＜0.05)，NCPP处理抵抗了肿瘤对小鼠骨髓来源DCs的抑制。结论：1．NCPP具有显著的抗肿瘤效应。2．NCPP抗肿瘤机制之一是上调了DCs的数量和功能。第二部分NCPP对免疫性肝损伤的保护作用目的自1992年，Tiegs等应用ConA成功地诱发了小鼠特异性肝损伤起，这一实验模型已被广泛应用于肝细胞损伤的细胞学与分子生物学机制的研究。ConA诱导的肝损伤也是目前被用于研究人类自身免疫性肝病较为理想的实验动物模型。目前认为它主要是由众多免疫细胞，如CD4+T细胞、Mφ以及NKT细胞等活化及其分泌的细胞因子所引起的肝细胞损害，且损伤具有剂量依赖性。表现为血浆转氨酶增高，肝组织炎症加重，并伴有大量淋巴细胞和炎性细胞浸润。NCPP是一种疗效好，副作用低的新型免疫调节剂。具有低热源、无甲醛残留、颗粒小而均一、易于吸收等特性，这都增大了它的安全性和适用范围。我们前期的研究证明了NCPP可以活化机体的Mφ，参与机体的免疫调节。为了进一步说明NCPP在机体自身免疫性疾病中的作用，本实验采用不同剂量的NCPP预处理，旨在探讨适量NCPP在ConA诱导的小鼠急性肝损伤模型中的作用，并研究其作用机理，为NCPP进一步的临床应用奠定基础。方法1．血清转氨酶测定收集各处理组小鼠血清，根据ALT／AST试剂盒说明书，检测得出ALT／AST的活力单位。2．病理组织学分析常规取各处理组小鼠部分肝脏组织，4％中性甲醛固定24小时，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察肝脏内的病变程度。3．肝脏单个核细胞(MNCs)的制备脱颈椎处死各组小鼠，制备肝细胞悬液，Percoll密度梯度离心法分离肝脏单个核细胞，用PBS洗两次后，收集备用。3．1各组小鼠肝脏MNCs的数量将分离得到的各组小鼠肝脏MNCs用台盼兰染色记数，PBS调浓度为1×10~7／ml备用。3．2肝脏MNCs中NK细胞的变化情况取上述制备的各组肝脏MNCs(1×10~6个细胞)，分别加入PE-CD3 mAb和FITC-DX5 mAb，4℃避光染色30min，PBS洗两遍后上流式细胞仪检测分析。4．肝脏KC数量和功能的变化情况取上述制备的肝脏MNCs(1×10~6个淋巴细胞／管)，分别加入PE-F4／80 mAb，混匀，4℃避光染色30min，PBS洗三遍后上流式细胞仪检测分析肝脏KC的数量。4．1 KC分泌NO水平的检测另将分离得到的肝脏MNCs用RPMI1640完全培养基调浓度为1×10~6／ml，种96孔板，100μ／孔，培养48小时，收集上清，按照NO试剂盒说明书检测各组小鼠肝脏KC分泌NO的水平。4．2血清NO水平的变化情况收集各组小鼠血清，按照NO试剂盒说明书检测各组小鼠血清NO的水平。5．肝脏MNCs中CD4+T细胞的数量及活化情况检测另取MNCs细胞悬液(1×10~6个细胞)，加入PE-Cy5-CD4 mAb，PE-CD25 mAb，4℃避光染色30 min，PBS洗三遍后上流式细胞仪检测分析CD4+T细胞的数量及活化情况。结果1．NCPP可抑制ConA引起的小鼠血清转氨酶升高各组小鼠血清转氨酶测定结果显示：ConA模型组中ALT水平为404±52U／L，同时小鼠ALT水平上升较明显，6～8h达到高峰；ConA／NCPP组小鼠血清ALT水平为51±25U／L；同时，AST水平从426±33U／L下降到188±13U／L。与ConA模型组相比，NCPP处理显著降低小鼠血清ALT／AST的水平(P＜0.05)。2．NCPP可抑制ConA引起的小鼠肝脏病理损伤肝脏病理检测结果显示：与PBS对照组小鼠相比，ConA处理的模型组小鼠肝窦及中央静脉瘀血严重，肝细胞变性，炎性细胞浸润较多。而ConA／NCPP组小鼠肝组织切片中少见肝细胞点状坏死和炎性细胞浸润，病理改变情况较ConA处理的模型组轻。3．NCPP对肝脏MNCs及淋巴细胞的影响3．1NCPP对肝脏MNCs的影响用Percoll密度梯度离心法分离各组小鼠肝脏MNCs，计数结果显示，ConA／NCPP组肝脏MNCs的数量为1.67±0.28×10~6，ConA模型组为1.44±0.33×10~6，与PBS对照组的0.83±0.11×10~6相比，细胞数都显著增加(P＜0.05)。3．2 NCPP对肝脏NK细胞数量的影响流式细胞仪分析结果显示，与PBS对照组相比，ConA／NCPP组，ConA／CP组以及ConA处理的模型组中NK数量都有所增加，但是三组之间没有显著性差异(P＞0.05)；4．NCPP对各组小鼠KC数量和功能的影响流式细胞仪分析结果显示，与PBS对照组相比，ConA／NCPP组，ConA／CP组以及ConA处理的模型组中KC的数量都有所增加，但三组之间亦没有显著性差异(P＞0.05)。4．1 NCPP对各组小鼠KC产生NO的影响NO水平的检测结果显示，应用ConA／NCPP组小鼠KC分泌NO水平从模型组的2.83±0.06下降到2.19±0.02，两组之间具有显著性差异(P＜0.05)，表明，NCPP处理明显抑制了小鼠肝脏MNCs中KC产生NO的水平。4．2各组小鼠血清NO的检测结果与ConA处理的模型组小鼠相比，ConA／NCPP组小鼠血清NO水平从2.85±0.28降低到1.55±0.41(P＜0.05)，两组之间具有显著性差异。5．各组小鼠肝脏CD4+T细胞的数量及活化情况流式细胞仪分析结果显示，与PBS对照组相比，ConA／NCPP组，ConA／CP组以及ConA处理的模型组中CD4+T细胞的数量都有所增加，但三组之间亦没有显著性差异(P＞0.05)。同时，CD4+T细胞活化情况分析结果显示，ConA／NCPP组CD4+T淋巴细胞的活化率为18.2±5.17％，而ConA处理的模型组的活化率为34.1±3.43％，两组间具有显著性差异(P＜0.05)，表明NCPP处理组小鼠肝脏CD4~+T淋巴细胞的活化受到了明显的抑制。结论1．低剂量NCPP可以抑制ConA诱导的小鼠急性肝损伤2．低剂量NCPP抑制ConA诱导的小鼠急性肝损伤主要是通过抑制肝脏内CD4+T细胞活化及Mφ分泌NO