论文部分内容阅读
以日本结缕草（Zoysia japonica）为试验材料,采用叶片修剪方式施加机械胁迫,通过全基因组茉莉酸相关功能基因检索,并以机械胁迫下转录组测序辅助筛选,结合实时荧光定量检测分析等研究手段,对日本结缕草中茉莉酸合成及信号转导途径相关基因进行识别;在此基础上进一步对机械胁迫响应较强的基因进行表达验证,以分析日本结缕草中茉莉酸途径在修剪后的应答特征。借助响应于激素的顺式作用元件搜索及功能性转录调控位点识别,筛选出茉莉酸诱导的转录因子,对转录调控靶基因进行功能富集,构建茉莉酸介导的转录调控网络。对茉莉酸浓度、H2O2含量、过氧化物酶活性等生化指标测试,检测茉莉酸合成及信号转导平衡下的茉莉酸水平,在生理层面对修剪后茉莉酸就H2O2代谢所发挥的生物学功能予以验证。现主要结论如下:·对于茉莉酸合成途径相关基因的鉴定及修剪后应答检测:1)参考拟南芥（Arabidopsis thaliala）中茉莉酸相关功能基因研究进展,在日本结缕草全基因组范围内通过同源基因鉴定,获得15条At LOX同源基因,9条At AOS同源基因,2条At AOC同源基因,10条At OPR同源基因,4条At JAR1同源基因以及14条At JMT同源基因,囊括了日本结缕草茉莉酸合成各环节的主要调控基因;2)基于最佳比对策略将修剪条件下日本结缕草叶片转录组Unigene同上述基因匹配,选取其中的差异表达基因进行检测,茉莉酸前体合成通路中5个Zj LOX基因、3个Zj AOS基因、1个Zj AOS基因,4个Zj AOS基因的检测结果表明,在日本结缕草中存在快速应答与渐进上调两类茉莉酸合成响应路线;而茉莉酸活性分子生成阶段,1个Zj JMT基因在修剪后极短时间内剧烈上调表达,另有1个Zj JAR1基因在修剪后2 h开始主导合成;·对于茉莉酸信号转导途径相关基因的鉴定及修剪后应答检测:3)依照拟南芥注释,在日本结缕草基因组中通过多重序列比对法识别信号转导途径元件编码基因,识别到Zj COI1与Zj JAZ基因各8个;分别选取两个进行荧光定量检测,发现Zj COI1基因可在修剪后2 h内上调表达数十倍至上万倍,Zj JAZ可将茉莉酸信号转换为正效应或负效应两种类型的下游信号;·对于强烈响应于茉莉酸信号的转录因子筛选及下游靶基因功能网络构建:4)依照Plant TFDB标准分类得到的64个差异表达转录因子,Plant CARE搜索出其中49个具备茉莉酸信号响应顺式表达元件,并且JA与ABA对大量转录因子具有交叉诱导效应,而强烈传导JA信号的转录因子更具有数量与强度优势;5)茉莉酸浓度梯度检验确认1个茉莉酸信号响应转录因子RRTF,通过Fun TFBS分析流程获得下游靶基因,细胞组分层面富集分析显示它们的表达产物集中活跃于叶绿体、过氧化物酶体及细胞壁,生物学过程富集分析显示其功效围绕响应刺激主题,在分子功能上以参与氧化还原反应代谢为主;6)基于基因富集结果挑选部分靶基因构建功能网络,并通过实时荧光定量及H2O2生化代谢检测验证,茉莉酸经由RRTF可正向调控木质素前体合成、交联所需氧化剂H2O2的积累、氧化还原反应催化所需漆酶与阳离子过氧化物酶的生成,负向调控竞争性还原H2O2的中间电子供体抗坏血酸过氧化物酶的生成;7)实时荧光定量结果表明Zj LOX8、Zj OPCL、Zj AOX等茉莉酸合成调控基因将作为茉莉酸信号靶标形成正向反馈调节加速茉莉酸合成,由此刺激木质素前体合成及氧化还原反应环境的建立,使日本结缕草细胞壁在修剪后可以快速修复。