根据已知狂犬病毒株核蛋白基因(N)和糖蛋白基因(G)序列设计合成了4对检测引物和2对克隆引物,建立了狂犬病RT-PCR及套式PCR诊断技术;自英国引进3株荧光素标记的针对狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体,建立了狂犬病直接免疫荧光诊断技术。使用建立的诊断方法对云南省部分地区的56份犬脑组织样品(小脑、脑干、海马角)进行检测,结果检出阳性样品共计12份,阳性率21.4%。病犬脑组织样品RT-PCR和套式PCR检测结果与直接免疫荧光试验结果一致。同时对2006-2007年间云南曲靖(YNQJ07)、昭通(YNZT07)、楚雄(YNMD06)、保山(YNTC06)狂犬病毒株N基因和G基因进行RT-PCR扩增,克隆至pMD18-T载体进行测序,并与已知代表性毒株进行比对及系统发育分析。结果发现:云南狂犬病毒株均属于基因Ⅰ型毒株,YNQJ07、YNZT07、YNMD06以及近年部分广西、浙江、江苏、湖北、安徽、江西省毒株N基因和G基因核酸序列同源性分别介于97.0～99.3%、97.4～99.3%,与其它基因Ⅰ型毒株同源性分别介于86.3～90.2%、82.9～93.0%。YNTC06与泰国和部分广西毒株同源性介于95.0～95.8%,与其它基因Ⅰ型毒株同源性介于82.9～92.9%。研究表明YNQJ07、YNZT07、YNMD06属于亚组群Ⅱ毒株,YNTC06毒株属于亚组群Ⅲ毒株,云南狂犬病毒核蛋白和糖蛋白存在特异性氨基酸变异位点。用EcoRⅠ和XbaⅠ(N基因)或KpnⅠ(G基因)双酶切目的基因PCR产物,纯化回收后定向克隆至pPICZαA载体中,构建了酵母表达质粒pPICZαAN和pPICZαAG。