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背景: 结直肠癌是世界第三高发恶性肿瘤,侵袭、转移是患者死亡的主要原因。近年来,随着科学研究的不断发展,早期筛查、早期诊断以及治疗的改善,肿瘤死亡率已有所降低,但肿瘤患病人数仍在增加。磷脂酸磷酸酶2域1A(phosphatidic acid phosphatase type2domain containing1A,PPAPDC1A)为磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid phosphatase,PAP)家族的新成员,也称磷酸磷酸酶,可以催化多种磷酸酯的去磷酸化,其可能与细胞信号传导和癌症发展有密切关系。研究发现PPAPDC1A在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌中与肿瘤发生发展密切相关,但PPAPDC1A是否与结直肠癌的发生、发展相关尚不清楚。 目的: 以6种人结直肠癌SW480、SW620、RKO、HCT116、DLD1和LOVO细胞株为研究对象,分析PPAPDC1A在不同结直肠癌细胞株中的表达情况,并且通过体内外实验研究该基因对不同结直肠癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响。 方法: 1.利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测结直肠癌石蜡样本中PPAPDC1A的表达,并分析PPAPDC1A的表达与肿瘤分化、分期、转移和临床预后等相关临床病理参数的关系; 2.利用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)方法检测PPAPDC1A mRNA和蛋白在结直肠癌细胞中的表达。 3.建立PPAPDC1A稳定过表达和干扰的结直肠癌细胞株,利用qRT-PCR和Western blot实验检测PPAPDC1A的表达情况。 4.通过CCK-8、平板克隆形成和裸鼠皮下成瘤实验检测PPAPDC1A对结直肠癌细胞株增殖能力的影响。 5.利用Transwell、划痕愈合实验和裸鼠肺转移模型实验检测PPAPDC1A对结直肠癌细胞侵袭、迁移和转移能力的影响。 结果: 1.PPAPDC1A在结直肠癌组织中的表达:IHC结果显示PPAPDC1A阳性表达主要定位于细胞膜和部分细胞质,呈棕红色或黄褐色。在73.3%(44/60)的结直肠癌病例中,肿瘤组织中PPAPDC1A蛋白表达水平高于相配对的正常结直肠组织;PPAPDC1A的表达水平和临床病理参数之间的关系:结果显示PPAPDC1A的表达水平在不同年龄组、不同性别、肿瘤大小及转移和非转移的结直肠癌之间没有显著差异(P>0.05);PPAPDC1A的表达水平在不同分化程度的结直肠癌中的差异具有统计学意义(P<0.05)并且二者之间呈负相关关系。 2.PPAPDC1A在结直肠癌细胞株中的表达:Western blot和qRT-PCR结果显示PPAPDC1A在6种结直肠癌细胞中存在差异性表达(P<0.05),选择相对高表达LOVO、SW620细胞,相对低表达RKO、SW480细胞进行后续实验。 3.PPAPDC1A过表达和干扰慢病毒载体的构建、稳定表达细胞株的建立:利用分子克隆技术构建了过表达和干扰的慢病毒表达载体,测序鉴定,结果显示插入的序列正确,无突变、缺失或者框移。采用基因转染技术成功构建PPAPDC1A过表达细胞株SW480-PPAPDC1A、SW480-Vector;RKO-PPAPDC1A、RKO-Vector;以及PPAPDC1A稳定干扰细胞株SW620-shPPAPDC1A、SW620-NC;LOVO-shPPAPDC1A、LOVO-NC,并采用qRT-PCR、Western blot方法进行了验证。 4.PPAPDC1A稳定过表达和干扰对结直肠癌细胞增殖能力的影响:CCK-8实验结果显示,与对照组相比PPAPDC1A稳定过表达细胞株的生长速度显著增快(P<0.05);PPAPDC1A被干扰的细胞株的生长速度显著慢于对照组(P<0.05)。平板克隆形成实验结果显示,与对照组相比PPAPDC1A稳定过表达细胞形成的克隆数量显著增多、克隆面积明显增大,PPAPDC1A被干扰的细胞株形成的克隆数量显著少于对照组、克隆面积明显减小(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组相比PPAPDC1A过表达组肿瘤生长速度较快,肿瘤体积较大(P<0.05),PPAPDC1A干扰组肿瘤生长速度较慢,肿瘤体积较小(P<0.05);并且PPAPDC1A过表达组Ki-67的阳性率(75%)显著高于对照组(35%)(P<0.05),PPAPDC1A干扰组Ki-67的阳性率(25%)显著低于对照组(76%)(P<0.05)。 5.PPAPDC1A稳定过表达和干扰对结直肠癌细胞侵袭、迁移和转移能力的影响:Transwell细胞侵袭实验结果显示,与对照组相比PPAPDC1A稳定过表达的细胞株穿过小室基底膜的细胞数量显著多于对照组(P<0.05);而PPAPDC1A被干扰的细胞株穿过小室底膜的细胞数量显著少于对照组(P<0.05)。划痕实验结果显示,与对照组相比PPAPDC1A稳定过表达的细胞株迁移速度明显增快;而PPAPDC1A干扰细胞株细胞迁移的速度则显著慢于对照组。裸鼠肺转移模型实验结果显示,PPAPDC1A稳定过表达细胞形成的肺转移裸鼠的数量及肺部肿瘤个数明显大于对照组(P<0.05);而PPAPDC1A干扰组细胞形成的肺转移裸鼠的数量及肺部肿瘤个数明显小于对照组(P<0.05)。 结论: 1.结直肠癌组织中PPAPDC1A表达水平显著上调;PPAPDC1A的表达水平与肿瘤分化之间呈负相关关系。 2.PPAPDC1A过表达促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移和转移能力,而PPAPDC1A干扰后则抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和转移能力。