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糖蛋白质组学(Glycoproteomics)主要是研究蛋白质糖基化修饰的学科,包括糖蛋白质序列的鉴定、糖基化修饰位点的分析、糖链结构的分析和糖链序列的分析。但是,目前的技术方法只能做到高通量鉴定糖基化修饰发生的位点和低通量鉴定糖链结构,完整的糖肽的分析还处在探索阶段。就高通量鉴定糖基化位点而言,目前所用的基于酰肼化学富集法和凝集素富集法所鉴定到糖基化位点的数目很有限。通常一种生物样品(如细胞、组织等)中很少能鉴定到1000多个糖基化位点。说明糖基化肽段/蛋白的样品处理和富集方法还需要优化。本论文就高通量鉴定糖基化位点中的糖基化肽段富集方法进行了系统的优化,以获得最大数量的N-链接糖基化位点数据,并对鉴定的N-链接糖基化位点数据进行假阳性控制。最后将建立的糖基化富集方法运用到OVC、ADR和HepG2等细胞系的N-链接糖蛋白质组学研究中。
本论文分为两个部分,第一部分优化了基于凝集素的糖肽富集方法,建立了基于SPE-离心柱的凝集素富集方法。该方法在实验测试时要优于Glyco-FASP凝集素富集方法。不仅操作简单,而且鉴定到了更多的N-链接糖基化位点。将该方法应用到OVC和ADR细胞系N-链接糖蛋白质组学研究,分别鉴定到了887和986个糖蛋白,其中692个糖蛋白是两个细胞共同拥有的,195个糖蛋白是OVC细胞系特有的,276个糖蛋白是ADR细胞系特有的。
论文的第二部分,建立了基于酰肼化学富集N-链接糖基化位点鉴定技术方法,并与所建立的SPE-离心柱的凝集素富集方法进行比较。利用SPE-离心柱凝集素富集方法从HepG2细胞系中鉴定到1879个N-链接糖基化位点和825个糖蛋白。利用酰肼化学富集法从HepG2细胞系中能鉴定到1014个N-链接糖基化位点和522个糖蛋白。两种方法共鉴定到1936个N-链接糖基化位点和853个糖蛋白。而酰肼化学法单独只鉴定到了91个N-链接糖基化位点和38个糖蛋白。结果表明凝集素富集法基本上覆盖了酰肼化学富集法鉴定到的糖基化位点,显示出凝集素富集法的优越性。该部分还讨论了糖基化位点鉴定的假阳性问题。实验得到的凝集素的平均假阳性率为2.5%,酰肼法富集的假阳性率为1.7%,可以看出凝集素富集法在提高糖基化位点数目鉴定数的同时也增加了假阳性率。
本文数据显示凝集素富集法和酰肼富集法对糖肽的富集并不是互补的关系,而是包含的关系。在实际样品测试时,应该优先采用凝集素富集法。