普瑞巴林(Pregabalin,PGB)商品名为乐瑞卡,作为一种γ-氨基丁酸(GABA)类似物,主要用于治疗癫痫疾病,应用前景广阔。本论文旨在建立重组大肠杆菌产疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶的高密度、高表达发酵工艺,并制备该脂肪酶交联酶聚集体。以下是具体研究内容:论文对产Thermomyces lanugnosa脂肪酶(TLL)的基因工程菌J.coli BL21(DE3)/pET28b-TLL进行了 5 L发酵罐水平发酵产酶工艺研究,通过单因素实验分别考察分批发酵工艺中培养条件、诱导方式对菌体生长和产酶的影响并进行了优化。结果表明,较佳的工艺为:菌体生长温度37℃,诱导温度28℃,搅拌转速500 rpm,通气量2.0 L/min,在OD600达到8左右用15g/L乳糖诱导,发酵时间20h。在优化的条件下,最终得到菌体干重为20.2g/L,体积酶活800.3 U/L。在分批发酵工艺的基础上进一步建立了补料发酵工艺:菌体生长温度37℃,搅拌转速500 rpm,通气量2.0 L/min,12 h后溶氧维持在最低点时开始补料,溶氧联动转速,控制溶氧在30%。补料策略:溶氧反馈控制,当溶氧高于30%时补加培养基,补料速率为20 mL/min,补料周期为2s/30s;氨水与盐酸将pH控制在7.0;在OD600达到60左右开始诱导,诱导温度28℃,诱导剂为30 g/L乳糖,发酵42 h。在优化的工艺下,最终得到菌体干重为71.8 g/L,体积酶活达到 4030.2 U/L。对发酵所得菌体进行超声破碎,利用获得的粗酶液制备的交联酶聚集体活力是游离酶的1.59倍。制备条件为:冰浴下,添加60%饱和硫酸铵,酶聚集沉淀1h;加入2%(v/v)戊二醛,交联2 h;添加剂为SDS,浓度为7.5 mg/mL;6000 r/min离心6 min,去上清,选择100 mmol/LpH= 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗2次。对制备的疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶交联聚集体的性质进行研究:最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0,在pH=9.0的Tris-HCl缓冲液(100mmol/L)中保存26天后,活力剩余60%,35℃下,7天内活力无损失,15天后活力仍保持70%以上,35℃半衰期为19天,重复使用8次后,酶活仅损失10%,4℃条件保存,60天后活力保持在89%以上。