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松树萎蔫病自上世纪以来一直是林业上的毁灭性病害。一般认为,松树萎蔫病的病原微生物为松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)。由于目前对于松材线虫的防治尚无经济有效的措施,严格检验检疫是阻止该病的发生、传播和蔓延最重要的途径之一。由于拟松材线虫(Bursaphelenchusmucronatus)具有和松材线虫极其相似的外形特征,而难以将这两种线虫区分,针对这个问题,本文对这两种线虫的形态学以及分子生物学的鉴定方法进行比较研究,以便找出一种准确、便捷的检验检疫方法。
本研究分别收集了不同来源的40种松材线虫和拟松材线虫,并进行了形态学鉴定。虽然两种群之间根据雌虫的尾尖突的不同可以将其粗略区分开来,但由于这一特征的不稳定性,并不能将两种线虫准确的区分。
在ITS-RFLP(Restrictionfragmentlengthpolymorphisim)研究中,首先探讨了线虫DNA的最佳提取方法,确认采用SDS法提取线虫基因组DNA,并以ITS区特异性引物分别对松材线虫和拟松材线虫扩增,均获得了950bp左右的扩增片段。进一步利用AluⅠ,HinfⅠ,MspⅠ,HaeⅢ和RsaⅠ五种内切酶分别对扩增片段进行酶切鉴定。结果表明,五种酶的任何一种都能区分松材线虫和拟松材线虫,而内切酶HaeⅢ,RsaⅠ还能准确区分亚洲型和欧洲型的拟松材线虫群体。
此外,本文还利用6种不同的随机引物,通过RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技术对松材线虫和拟松材线虫的基因组DNA进行随机扩增,以探讨区分种间及种内群体的亲缘关系的简便方法,结果显示:利用OPB07和OPX01为随机引物,RAPD法可以明显区分松材线虫和拟松材线虫并与形态学分类结果相吻合;以OPY01为随机引物扩增后进行聚类分析的结果也表明,线虫种内和种间均存在差异,同种线虫在同一地区或临近地区的同源性明显高于其它地区,而同一地区内寄主对线虫同源性的影响较小。另外,系统发育关系的研究结果显示出我国松材线虫和北美松材线虫群体有较高的同源性,表明我国部分地区的松材线虫可能来源于北美大陆。