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研究背景肝脏在脓毒症中是一把双刃剑,一方面介导免疫应答清除细菌和毒素,另一方面引起炎症、免疫抑制和器官损伤。尽管脓毒症的治疗取得了进展,但其发病率和死亡率仍然很高[1]。脓毒症后的肝功能障碍是脓毒症患者死亡的独立危险因素。改善肝功能可降低脓毒症患者的发病率和死亡率[2-5]。生长停滞特异性蛋白6(Growth arrest-specific protein 6,Gas6)是一种维生素K依赖的分泌型蛋白,由678个氨基酸组成,相对分子质量为75k Da。它与蛋白S(Protein S,Pro S)具有43%的相同序列。其为酪氨酸激酶亚家族成员Tyro3、Axl、Mer的配体[6]。Gas6具有广泛的抑制炎症的功能,一方面降低TLRs信号,另一方面在炎症恢复阶段参与巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬[7]。有大量研究表明Gas6/TAM可通过直接抑制TLRs,抑制炎症相关基因TNF-α、IL-1β、IFN-α和NF-κB的表达而发挥抗炎作用。本项目通过LPS/D-Gal N复制小鼠急性肝损伤模型,通过分子生物学手段探究Gas6对LPS/D-Gal N急性肝损伤的作用及机制。研究内容第一部分:LPS/D-Gal N急性肝损伤小鼠模型的构建及Gas6的表达目的:复制小鼠脓毒症急性肝损伤模型,评价不同时间节点肝脏损伤标记物及病理损害,通过RT-PCR方法检测Gas6在脓毒症急性肝损伤中的表达,为进一步的研究建立理论基础。方法:SPF级C57BL/6小鼠,随机分为3组:对照组、3小时LPS/D-Gal N、5小时LPS/D-Gal N组。每个时间点采血检测血清ALT,AST,IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α。取肝组织检测MPO水平。RT-PCR测定Gas6表达。结果:1.小鼠血清肝脏损伤标记物水平同对照组相比,LPS/D-GalN组血清ALT、AST水平随时间进行性升高,造模3小时LPS/D-Gal N组血清ALT、AST升高,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01);造模5小时LPS/D-Gal N组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。2.各组小鼠血清炎症因子水平比较同对照组相比,炎症因子IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α水平随时间进行性升高,术后3小时IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01);术后5小时IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。3.小鼠肝脏病理改变及肝损伤病理评分结果正常对照组小鼠的肝脏组织结构正常,结构清晰,LPS/D-Gal N组结构异常、肝细胞水肿、空泡变性。LPS/D-Gal N组术后肝脏病理损害随时间逐渐加重。4.一般状态对照组活动正常,可自由进食,无寒战,倦怠;LPS/D-Gal N组麻醉苏醒慢,出现竖毛,寒战,倦怠。5.Gas6 m RNA水平比较LPS/D-GalN组同对照组比较,Gas6 mRNA水平在术后5小时显著下降(P<0.01)。结论:1.LPS/D-Gal N组小鼠出现肝损伤表现,肝损伤标志物血清ALT、AST及炎症因子IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α水平显著增高,肝组织病理改变符合脓毒症急性肝损伤表现,肝脏病理损害加重,成功复制急性肝损伤模型。造模5小时可作为取材时间点。2.脓毒症急性肝损伤中Gas6表达下降,可进一步给予外源性rmGas6干预。第二部分:重组小鼠Gas6(rm Gas6)对LPS/D-Gal N诱导的急性肝损伤小鼠肝功能保护作用目的:研究外源性rm Gas6对脓毒症急性肝损伤小鼠肝功能影响,检测rm Gas6对炎症指标的影响。方法:SPF级C57BL/6小鼠,随机分为3组:对照组、LPS/D-Gal N组、LPS/DGal N+rm Gas6组。选择LPS/D-Gal N 5小时为造模终点,每组取10只小鼠,留取血液及肝脏标本,抽血检测血清ALT、AST水平。ELISA法及RT-PCR方法分别检测炎症因子IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α水平。肝组织行HE染色,并观察肝脏病理损害情况。结果:1.同对照组相比,脓毒症急性肝损伤组小鼠肝脏病理损害明显加重;同LPS/DGal N组相比,LPS/D-Gal N+rm Gas6组小鼠肝脏病理损害程度减轻。2.肝损伤指标方面,同对照组相比,LPS/D-Gal N组小鼠血ALT、AST表达水平显著增加(P<0.01),同LPS/D-Gal N组相比,LPS/D-Gal N+rm Gas6组血ALT、AST水平显著降低(P<0.01)。3.血清检测炎症指标,同对照组相比,LPS/D-Gal N组小鼠肝脏组织IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α水平显著增加(P<0.01),同LPS/D-Gal N组相比,LPS/D-Gal N+rm Gas6组小鼠肝脏组织IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。4、相比于对照组,LPS/D-Gal N组肝脏组织IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-10 m RNA表达显著升高(P<0.01),同LPS/D-Gal N组相比,LPS/D-Gal N+rm Gas6组小鼠肝脏组织IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-αm RNA表达显著下调(P<0.01)。结论:1.rm Gas6能够改善脓毒症急性肝损伤。2.rmGas6能够下调血液中IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α及小鼠肝脏组织中IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-αm RNA水平。3.rm Gas6对肝脏有较好保护作用。第三部分:重组小鼠Gas6(rm Gas6)对LPS急性肝损伤小鼠肝功能保护作用机制的研究目的:探讨rmGas6对脓毒症急性肝损伤小鼠肝脏细胞凋亡的影响,探讨rmGas6对脓毒症急性肝损伤小鼠肝脏NF-κB信号转导通路的影响。旨在发现rm Gas6在脓毒症急性肝损伤保护的潜在机制。方法:SPF级C57BL/6小鼠,随机分为3组:对照组、LPS/D-Gal N组、LPS/DGal N+rm Gas6组。选择LPS/D-Gal N 5小时为造模终点,每组取10只小鼠,留取血液及肝脏标本,对肝脏组织进行TUNEL染色观察肝脏细胞凋亡情况。采用免疫印迹法检测检测cleaved caspase-3蛋白的表达情况,同时检测NF-κB通路中p65,IκBα等蛋白的表达情况。分别使用免疫印迹法及RT-PCR方法检测Bax及Bcl-2的表达情况。结果:1.rm Gas6对脓毒症肝损肝组织凋亡的影响同对照组相比较,LPS/D-Gal N组肝脏cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05),LPS/D-Gal N+rm Gas6组cleaved caspase-3水平降低(P<0.05)。与对照组相比较,LPS/DGal N组Bax蛋白表达显著升高,LPS/D-Gal N+rm Gas6组Bax蛋白表达水平降低(P<0.05)。相比于对照组,LPS/D-Gal N组肝脏Bcl-2蛋白表达减低(P<0.05),LPS/DGal N+rm Gas6组可使肝组织Bax蛋白水平上升(P<0.05)。对肝组织中Bax及Bcl-2的m RNA检测发现相同趋势。2.rm Gas6对急性肝损伤NF-κB通路的影响相比于对照组,LPS/D-GalN组磷酸化的IκBα、磷酸化的p65、细胞核中p65表达显著增多,提示NF-κB激活。LPS/D-Gal N+rm Gas6组同LPS/D-Gal N组相比,磷酸化的IκBα、磷酸化的p65、细胞核中p65表达降低。以上结果表明rm Gas6干预能够抑制NF-κB通路活化状态,从而改善脓毒症急性肝损伤。结论:1.在脓毒症急性肝损伤小鼠的模型中肝细胞凋亡增加,rm Gas6能够改善肝脏细胞凋亡。2.在脓毒症急性肝损伤小鼠的模型中,肝脏NF-κB信号通路激活。rm Gas6能够抑制NF-κB通路激活,从而减轻急性肝损伤。