柑橘是世界上种植最广泛和最具经济价值的多年生木本果树。由于其具有雌雄败育、童期长及珠心胚干扰等特性,常规育种遇到了很大的阻碍。随着生物技术研究的发展,分子细胞育种已成为柑橘育种的新途径。体细胞胚发生是分子细胞育种中离体保存和遗传改良的必要环节。目前绝大多数柑橘品种的愈伤组织在长期离体保存过程中胚胎发生能力逐渐减弱甚至完全丧失,这已阻碍了分子细胞育种的步伐。此外,柑橘珠心胚(活体体细胞胚)因具有固定农作物杂种优势的潜能而备受关注,但其分子机理有待探究。因此,深入理解柑橘体细胞胚发生机制成为了一个亟待解决的问题。本研究筛选出适合柑橘体细胞胚发生及不同组织的内参基因;验证一个B3家族转录因子Cs FUS3在柑橘愈伤组织体细胞胚发生过程中具有促进生胚的作用;结合细胞学观察珠心胚起始细胞出现的关键时期,利用RNA-seq技术比较两对单胚和多胚品种在转录水平上的差异,分析柑橘珠心胚起始发生的分子机制。主要研究结果如下:1.筛选柑橘体细胞胚发生及不同组织内参基因。对10个候选内参基因(Cit ACT7、Cite IF-1A、Cite IF4α、Cit Histone H3、Cit Histone H4、Cit TUA3、Cit TUB8、Cit UBL5、Cit UBQ1和Cit UBQ14)在多个柑橘样本组中的表达稳定性进行了评估,包括三个温度处理条件下(20℃、25℃和30℃)的7个体细胞胚发育时期、5个柑橘器官、4个花组织以及4个花发育时期。分别用ge Norm、Norm Finder和Bestkeeper三种软件分析候选基因的表达稳定性。ge Norm软件同时用于确定每个实验组最优内参基因组合数目。经过对三种软件分析结果综合排序,表明Cit UBQ1是“所有样本组”、“花发育时期组”、“温度处理-体细胞胚发育组”以及“常温诱导-体细胞胚发育组”最稳定的单内参;Cit UBQ14是“花器官组”和“组织组”最稳定的单内参;而Cit Histone H3则是各个实验组中最不稳定的内参。利用不同的候选内参基因分别对Cit SERK1-like的表达进行归一化分析,表明筛选出来的内参基因可靠性强。2.Cs FUS3基因的克隆及体细胞胚发生功能鉴定。采用RACE技术克隆Cs FUS3基因全长。转录水平上,Cs FUS3主要在胚性愈伤组织及其发育的体细胞胚中表达,并且其表达量与不同柑橘品种体细胞胚发生能力呈正相关,但其蛋白含量在胚性愈伤组织中表达很低。在完全丧失体细胞胚发生能力的‘国庆一号’愈伤组织中超量表达Cs FUS3能使其恢复胚胎发生能力。利用RNA-seq比较超量表达Cs FUS3转基因系与空载对照系在转录组水平上的差异,发现促进体细胞胚发生的转录因子在超量表达系上调表达;参与激素合成、降解和信号转导基因被激活。在体细胞胚发育过程中及不同柑橘品种愈伤组织中,ABA/GA比例的变化趋势与Cs FUS3的表达趋势呈正相关。超量表达系不但具有更高的ABA/GA比例,而且在ABA和GA拮抗剂处理条件下表现出更强的体细胞胚发生能力。3.转录组分析发掘珠心胚起始关键基因。通过石蜡切片确定珠心胚起始细胞出现的关键时间点。以P-value≤0.05且差异≥2倍作为筛选差异基因的标准,利用RNA-seq比较分析两对多胚与单胚(鸡尾葡萄柚/华农红柚,清江椪柑/克里曼丁橘)胚珠在转录水平的差异。筛选出71个在两对材料中共同差异的基因。这些单胚或多胚富集的基因主要参与细胞壁的修饰和合成、激素的合成和信号转导、转录调控和逆境反应。其中,调控胼胝质合成的UGT1基因在多胚品种珠心胚起始过程上调表达,暗示胼胝质的合成与珠心胚的起始过程密切相关。