近年来,纳米材料的独特性质使得纳米科技得到蓬勃发展,越来越多的纳米材料被应用于生物医学、食品添加剂、化妆品和工业材料等众多领域。人们日益关注其对人体及环境潜在的风险。因此,我们需要全面且深入的评估纳米材料的生物安全性。当纳米颗粒进入到生物体环境后,其表面会被体液中的蛋白质迅速覆盖形成纳米颗粒-蛋白复合物,该复合物被称作蛋白冠,而蛋白冠将赋予纳米颗粒一种新的生物识别特性。纳米颗粒的生物学效应最终将由蛋白冠的特性所决定。因此,通过研究纳米颗粒与生物体液中蛋白质相互作用形成蛋白冠的过程将有利于我们更深入的理解蛋白冠形成的规律及生物效应。自噬是一个进化上严格保守的细胞自我循环过程,对维持细胞的正常生理功能起着重要的作用。自噬水平的异常通常会导致细胞的功能障碍。许多疾病如癌症、神经退行性疾病和代谢失常等疾病的发生也与自噬密切相关。目前,已有许多研究报道纳米颗粒作为外源性物质进入细胞后能够导致细胞自噬水平的升高。然而对于蛋白冠的存在将如何影响裸露纳米颗粒诱导的细胞自噬效应的报道较少。纳米颗粒进入生物环境后,并不会直接与生物体作用,而是首先吸附体液环境中的蛋白质形成蛋白冠后,再与细胞相互作用,进而引发后续的生物效应。而且纳米颗粒也可能会通过吸附体内关键的酶而改变酶的生物学功能进而引发细胞的毒性。因此,深入了解纳米颗粒-蛋白复合物的生物学特性及蛋白冠介导的自噬效应极其重要。研究该课题将有助于我们更全面深入的评估SiO2 NPs在生物医学领域的应用。对纳米颗粒-酶复合物的研究也使我们更深入了解纳米颗粒对酶生物活性的影响。在本工作中,我们系统的分析了二氧化硅纳米颗粒（SiO2 NPs）与血液蛋白质相互作用的规律,发现SiO2 NPs对纤维蛋白原（Fg）的吸附能力最强,且Fg蛋白能够阻止SiO2 NPs的沉降作用,进而降低NPs与细胞膜的黏附。同时,Fg蛋白还能显著的缓解SiO2 NPs诱导的非吞噬细胞自噬效应。此外,我们还发现SiO2 NPs能够吸附过氧化氢酶（CAT）并改变该酶的二级结构进而改变其生物学活性。本论文的研究内容主要分为以下几个部分。第一部分:该部分旨在探究SiO2 NPs与不同血液蛋白质相互作用的规律和特点。在本章实验中,我们选择了牛血浆FBP、牛血清FBS、以及牛源白蛋白BSA、纤维蛋白原Fg和血红蛋白Hb三种蛋白作为模型蛋白来进行体外研究。我们通过SDS-PAGE实验发现SiO2 NPs与FBP孵育后吸附的主要蛋白种类包括BSA,Fg和Hb蛋白。而BSA和Hb蛋白为SiO2 NPs吸附FBS中蛋白的主要部分。随着FBS浓度的增加,SiO2 NPs表面吸附的蛋白量和种类都分别依次增加。同时,我们的银染结果初步表明SiO2 NPs对三种蛋白的吸附能力不同,SiO2 NPs对BSA的吸附量要明显低于Fg和Hb蛋白,吸附量较多的说明两者之间的亲和力更强,反之则说明纳米颗粒表面与蛋白之间只有相对较弱的亲和力。接下来的BCA蛋白定量实验表明SiO2 NPs对三种蛋白吸附能力大小顺序为Fg＞Hb＞BSA。我们还通过TEM观察SiO2 NPs及SiO2 NPs吸附不同蛋白形成的复合物蛋白冠（Protein@SiO2 NPs）的形貌和粒径,发现SiO2 NPs与FBS及不同单一蛋白孵育形成蛋白冠后,Protein@SiO2 NPs的粒径相比裸露的SiO2 NPs均有所增加,并且Fg@SiO2 NPs的粒径增加的最显著。我们进一步通过DLS对SiO2 NPs及Protein@SiO2 NPs的流体动力学直径和Zeta电位进行测定,结果发现相比于SiO2 NPs组,BSA@SiO2 NPs和Hb@SiO2 NPs两组的流体动力学直径显著增加,而Zeta电位的绝对值明显降低,这表明BSA@SiO2 NPs和Hb@SiO2 NPs悬浮液体系的稳定性降低,而Fg@SiO2NPs和FBS@SiO2 NPs两组的Zeta电位的绝对值变化不显著。我们还发现蛋白冠在较短时间内就可以形成。并且温度和p H值也是影响纳米颗粒吸附蛋白量的重要影响因素。此外,我们还发现SiO2 NPs与三种蛋白形成的蛋白冠非常稳定,即使在高温煮沸的情况下,也只有少量的蛋白才会从SiO2 NPs表面解离下来。在蛋白变性剂十二烷基硫酸钠SDS存在时蛋白质才能从SiO2 NPs表面解离下来。我们接下来使用圆二色光谱法（CD）分析每一种蛋白质被SiO2 NPs吸附前后的二级结构变化,结果发现随着SiO2 NPs浓度的增加,BSA和Hb蛋白的α-螺旋和β-转角变化显著,而无规卷曲的值变化较少。Fg蛋白的α-螺旋从19.2%减少到14.4%,而其它三种二级结构值的变化较小。该结果表明BSA和Hb蛋白被吸附到SiO2 NPs的表面后,蛋白的结构发生了明显的改变,使蛋白骨架发生伸展。而Fg蛋白的结构变化的很小,说明蛋白骨架结构相对保持完整。我们又通过多重光散射技术分析了不同纳米颗粒-蛋白复合物悬浮液的体系稳定性。我们的结果显示,在48 h内,不同蛋白冠体系的稳定性大小顺序为:FBS@SiO2＜SiO2＜Fg@SiO2＜BSA@SiO2＜Hb@SiO2,该结果表明FBS和Fg蛋白能够阻止SiO2 NPs的沉降作用,对SiO2 NPs混悬液起到稳定的作用。而BSA和Hb蛋白则不能。通过本章实验证明,SiO2 NPs分别吸附BSA、Fg和Hb三种血液蛋白后会使SiO2 NPs的粒径增加,并且发现SiO2 NPs对Fg蛋白的吸附能力最强,Fg蛋白的吸附使得SiO2 NPs的粒径增加最多。体系的温度和p H值会影响SiO2 NPs对蛋白的吸附量。此外,SiO2 NPs对BSA和Hb蛋白的二级结构影响较大,对Fg蛋白影响较小。同时Fg蛋白能够阻止SiO2 NPs的沉降作用,起到稳定SiO2 NPs混悬液的作用。第二部分:该部分旨在探究不同蛋白冠对SiO2 NPs诱导的自噬效应的影响。在本章中,我们发现SiO2 NPs能够诱导HUVEC和RAW264.7两种细胞产生显著的自噬效应,且呈浓度依赖效应。同时,我们还检测了SiO2 NPs对两种细胞的毒性效应,结果显示HUVEC和RAW264.7细胞经SiO2 NPs处理后,存活率均呈现出明显的降低,且呈浓度依赖性。我们通过透射电子显微镜（TEM）观察细胞内自噬体的数量来判断自噬发生的水平。结果发现Fg蛋白能够显著降低SiO2 NPs诱导的自噬体的数量,同时减少HUVEC细胞对SiO2 NPs的摄取。而BSA蛋白却没有该效应。该结果提示我们可以通过使用不同的蛋白在SiO2 NPs的表面形成蛋白冠后用于细胞自噬水平的调控。接下来我们通过检测自噬标志蛋白LC3的表达水平来进一步评估BSA和Fg蛋白对SiO2 NPs诱导的自噬效应的影响。我们选择了两种非吞噬细胞A549和HUVEC,以及两种吞噬细胞RAW264.7和J774A.1来研究,结果发现无论是癌细胞A549还是非癌细胞HUVEC,蛋白Fg包裹的SiO2 NPs都显著的降低了自噬关键蛋白LC3B-Ⅱ的表达,而BSA蛋白包裹的SiO2 NPs诱导的细胞自噬水平则和裸露的SiO2 NPs趋近一致。该结果表明Fg蛋白确实在缓解SiO2 NPs诱导的非吞噬细胞自噬效应中起到关键的作用。然而有趣的是,在吞噬类细胞中却出现了不一样的情况,无论是在RAW264.7中还是在J774A.1细胞中,Fg蛋白和BSA蛋白都没有明显降低SiO2 NPs诱导的细胞自噬效应,该结果表明Fg蛋白缓解SiO2 NPs诱导的细胞自噬效应与细胞类型相关。同时,我们还发现Fg蛋白只是延迟了SiO2 NPs诱导的细胞自噬效应。因为随着时间的延长,Fg蛋白缓解SiO2 NPs诱导的自噬效应的作用会消失。接下来我们继续探究Fg蛋白是否会随着纳米颗粒进入到细胞内。为了便于观察,首先我们将Fg蛋白用荧光素花青素-N-羟基琥珀酰亚胺酯（Cy3）标记为红色的荧光蛋白Fg-Cy3,再与SiO2 NPs孵育形成荧光蛋白冠,最后观察其与细胞的相互作用。我们发现随着作用时间的延长,HUVEC细胞内的荧光蛋白冠逐渐增加,表明细胞对Fg-Cy3@SiO2 NPs的摄取呈时间依赖。以上实验结果表明,Fg蛋白的包裹在一定的时间内能显著的缓解SiO2 NPs诱导的非吞噬细胞自噬效应,但不能缓解SiO2 NPs诱导的吞噬细胞的自噬效应。而BSA蛋白则既不能缓解SiO2 NPs诱导的非吞噬细胞自噬效应也不能缓解吞噬细胞的自噬效应。第三部分:该部分旨在探究SiO2 NPs及BSA和Fg蛋白分别包裹的SiO2 NPs与细胞接触并进入细胞的过程。本章中为了使SiO2 NPs便于观察,我们首先制备了包覆带红色荧光量子点QDs的荧光SiO2 NPs（QDs@SiO2 NPs）。我们同样发现Fg蛋白同样能够降低QDs@SiO2 NPs诱导的非吞噬细胞HUVEC的自噬效应。而在RAW264.7细胞中则没有此效应。细胞摄取NPs的第一步是混悬液中NPs首先通过沉降作用与细胞膜表面接触,然后再通过能量依赖的内吞作用进入到细胞内。通过高内涵实验分析QDs@SiO2 NPs及不同蛋白包裹的QDs@SiO2 NPs与细胞膜表面的黏附情况,我们将QDs@SiO2 NPs、BSA@QDs@SiO2和Fg@QDs@SiO2置于4℃的条件以防止被细胞内吞,仅分析第一个过程,即纳米颗粒及其蛋白冠黏附于细胞膜的过程。结果发现Fg蛋白能显著降低QDs@SiO2 NPs的沉降速率,而BSA蛋白则几乎不影响。该结果说明Fg蛋白能减少QDs@SiO2 NPs与细胞膜表面的接触。即Fg蛋白通过增加NPs在悬浮液中的稳定性而降低了其沉降速率,进而减少了NPs与细胞表面的黏附作用。接下来,我们通过共聚焦和流式细胞术分析了NPs及其蛋白冠进入细胞的第二个过程,即细胞对QDs@SiO2 NPs、BSA@QDs@SiO2和Fg@QDs@SiO2的摄取,为了排除上述NPs及NPs-蛋白复合物沉降速率的不同,我们将细胞分别暴露于少量NPs与NPs-蛋白复合物混悬液中,使其立即被黏附于细胞表面。结果表明Fg蛋白能够显著降低HUVEC和RAW264.7细胞对QDs@SiO2 NPs的摄取,而BSA蛋白则几乎不影响。ICP-OES的结果同样证明了Fg蛋白的包裹会明显降低细胞对SiO2 NPs的摄取。而BSA蛋白则几乎不影响。活细胞工作站的实验也同样证明了该结果。此外,我们还分析了QDs@SiO2NPs及Fg@QDs@SiO2进入细胞的内吞途径。探究Fg蛋白是否会改变QDs@SiO2NPs的主要内吞途径,结果发现QDs@SiO2 NPs与Fg@QDs@SiO2的主要内吞方式同样都是小窝蛋白介导的内吞作用。该结果表明在HUVEC和RAW264.7细胞中,Fg蛋白并没有改变QDs@SiO2 NPs进入细胞的主要内吞途径。以上实验结果表明,Fg蛋白能显著降低QDs@SiO2 NPs的沉降速率,而BSA蛋白则几乎不影响。同时,Fg蛋白能够显著降低HUVEC和RAW264.7细胞对QDs@SiO2 NPs的摄取,BSA蛋白也几乎不影响。此外,Fg蛋白并没有改变QDs@SiO2 NPs进入细胞的主要的内吞途径。第四部分:该部分旨在探究NPs与过氧化氢酶CAT和超氧化物歧化酶SOD两种抗氧化酶的相互作用及NPs对酶的结构与活性的影响。在本章中我们选择了两种纳米颗粒SiO2和Ti O2 NPs进行研究,首先我们比较了NPs对CAT和SOD的吸附能力,结果发现SiO2 NPs对CAT的吸附能力明显大于SOD。对于Ti O2 NPs也是一样的结果。同时,我们还发现SiO2NPs-NH2对CAT的吸附量要明显低于SiO2NPs。该结果表明SiO2 NPs表面不同的基团修饰会影响其对CAT酶的吸附能力。而且SiO2 NPs对CAT的吸附几乎不受温度的影响。此外,我们还发现对于CAT和SOD的吸附,SiO2 NPs的吸附能力要明显大于Ti O2 NPs。因此,我们选择SiO2 NPs进行后续的实验。我们继续研究SiO2 NPs是否会改变两种抗氧化酶的二级结构。结果发现抗氧化酶CAT和SOD被吸附于SiO2 NPs的表面后,CAT的二级结构发生了显著的变化,而SOD的二级结构只发生了轻微的改变。接下来我们又进一步探究了SiO2 NPs对两种抗氧化酶的生物活性的影响。结果发现SiO2 NPs的吸附会导致CAT酶活的改变,而几乎不影响SOD的酶活。并且还发现SiO2 NPs的吸附量与CAT酶活两者呈线性关系,CAT被吸附的越多,体系中总酶活就降低的越多。我们接着从分子水平探究一分子的SiO2 NPs可以结合几分子的CAT酶。通过荧光淬灭法分析得出SiO2 NPs和CAT的结合常数和结合位点。SiO2 NPs和CAT的结合常数Ka为3.0605 M-1,结合常数n为0.6257。该结果表明一分子SiO2NPs能够结合2分子的CAT酶。以上实验结果表明,通过本章的研究我们发现SiO2和Ti O2 NPs均能吸附抗氧化酶CAT和SOD形成蛋白冠且SiO2 NPs的吸附能力要明显大于Ti O2 NPs,而SiO2NPs对CAT的吸附量要明显大于SOD,进一步发现SiO2 NPs能改变CAT的二级结构与酶活,而对SOD则几乎没有影响。