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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)是可以导致感染猪发生免疫抑制的两种病毒。本研究通过分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒含量和血清抗体水平、外周血白细胞亚群以及外周血单个核细胞(PBMCs)中细胞因子mRNA转录的动态变化,揭示PRRSV和PCV2共感染对猪免疫功能影响的细胞和分子机制。
应用RT-PCR/PCR技术,分别扩增并克隆PRRSV、PCV2和猪细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TNF-α和β-actin的部分基因片段,获得了各种分子的阳性重组质粒。通过实时荧光定量PCR方法(Real-timeFQ-PCR),建立了这些病毒和细胞因子的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最适读板温度。
20头6周龄普通猪被分成空白对照组、PRRSV或PCV2单感染组以及PRRSV和PCV2共感染组4个组,每组5头。攻毒后,采用Real-timeFQ-PCR技术对感染猪血清、组织器官、PBMCs中的病毒含量进行检测,采用间接ELISA法对血清中的特异性抗体进行检测,采用MTT法对外周血淋巴细胞(PBLCs)的增殖能力进行检测。结果表明,PRRSV和PCV2共感染组血清、组织器官、PBMCs中PRRSV的含量均显著高于PRRSV单感染组,PCV2的含量均显著高于PCV2单感染组;PRRSV和PCV2共感染组血清中PRRSV、PCV2特异性抗体阳转的时间晚于并且水平低于PRRSV或PCV2单感染组;共感染和单感染组PBLCs增殖能力受到抑制的严重程度依次为:PRRSV/PCV2组>PRRSV组>PCV2组。由此表明,PRRSV和PCV2在猪体内的增殖具有相互促进作用,对感染猪体液免疫和细胞免疫的抑制具有加重作用。
采用血常规法、CD21和SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术对PRRSV、PCV2单感染和共感染猪外周血白细胞亚群的含量进行分析。结果表明,PRRSV和PCV2共感染组在感染早期(10DPI前)各类白细胞亚群含量比单感染组显著下降,白细胞、淋巴细胞、单核细胞、NK细胞、Tc细胞、活化/记忆T细胞下降特别明显;此后各类白细胞亚群含量逐渐上升,绝大多数在14~35DPI间显著升高。由此表明,在病毒感染早期,PRRSV和PCV2共感染可导致比单感染更加严重的免疫抑制,PRRSV和PCV2共感染对机体的免疫抑制具有加重作用。
采用Real-timeFQ-PCR技术对PRRSV、PCV2单感染和共感染猪PBMCs中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α)、Th1型细胞因子(IL-2、IL-12p40、IFN-γ)以及Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)mRNA转录水平进行分析。结果表明,PRRSV和PCV2共感染导致促炎细胞因子、Th1型和Th2型细胞因子mRNA转录水平的下调比PRRSV或PCV2单感染组更加严重,其中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和IFN-γ下调尤为明显。由此表明,PRRSV和PCV2共感染比单感染更加严重地抑制了机体的炎症反应、细胞免疫反应和体液免疫反应,PRRSV和PCV2共感染加重了猪的免疫抑制。
综合以上结果表明,PRRSV和PCV2共感染对它们在猪体内的增殖具有相互促进作用,对感染猪的免疫抑制具有加重作用。