儿茶素—卵黄免疫球蛋白复合物的制备及抑菌机制研究

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大肠杆菌及金黄色葡萄球菌会严重危害着人类健康,抗生素的出现可以有效缓解以上问题,但耐药性及药物残留问题限制了其应用。鸡卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin,IgY)作为蛋黄中存在的唯一抗体,对多种病原微生物具有良好的抑菌效果,具有重要的生理意义。但其在一定条件下不稳定,导致抗菌功效的发挥受到阻碍,一定程度上限制了其大规模应用。因此,需要通过物理化学改性修饰等方式,提高其抑菌性并缓解其在酸性胃液环境易消化降解等问题。基于此,本课题以IgY及儿茶素为研究对象,采用多光谱法探究两者的相互作用及抑菌性变化;对儿茶素-IgY复合物的制备工艺进行优化;以IgY及儿茶素为对照,探究复合物的功能特性变化;并对复合物的抑菌机制进行了初探。本课题在缓解抗生素使用带来的药物残留及耐药性问题和制备高附加值天然产物功能食品等方面具有重要意义。主要研究内容和结果如下:(1)采用多重光谱法,探究儿茶素对IgY结构的影响及两者的相互作用,并对比分析了抑菌性能的变化。结果表明:随着儿茶素浓度的增加,IgY的紫外可见吸收峰值逐渐升高并发生蓝移,最大吸收峰波长从279 nm蓝移至276 nm;儿茶素的引入使得IgY的荧光强度降低,产生荧光猝灭现象,且对其荧光猝灭效果随着儿茶素浓度的增加呈现增强趋势,并发生红移现象,两者相互作用的猝灭机制主要为儿茶素与IgY结合形成了结合位点接近于1的基态稳定复合物而导致的静态猝灭,范德华力及氢键作用力是儿茶素与IgY互作结合形成复合物的主要作用力类型。红外光谱结果表明添加儿茶素后3200 cm-1~3500 cm-1范围内的峰形变宽,吸收波数随着儿茶素添加量的增加而逐渐红移。复合物二级结构中β-折叠、β-转角含量无明显变化,α-螺旋含量升高、无规卷曲含量降低,表明儿茶素的引入使蛋白质构象发生变化;儿茶素与IgY能够相互作用形成复合物,复合物表现出较优的抑菌性能。(2)以IgY与儿茶素的比例、温度、时间、p H为影响因素,以结合度及抑菌率为响应值,对儿茶素-IgY复合物的制备工艺进行了优化。结果表明:IgY与儿茶素的比例为1:1.03,反应温度为41.2℃,反应时间为6 h,反应p H为6.06。此条件下结合度为75.36%,抑菌率为36.23%。经过验证试验,测得结合度为76.84±1.26%,实际值与预测值相差1.96%;抑菌率为35.51±0.97%,实际值与预测值相差1.99%。与拟合模型符合。(3)以儿茶素、IgY为对照组,对比分析儿茶素-IgY复合物的特性变化。以抑菌率为指标,对比分析三种样品在不同温度及p H条件处理下的稳定性,结果表明:复合物的热稳定性相比于儿茶素、IgY降低,酸碱稳定性较儿茶素与IgY提高。复合物的抗氧化活性相较于IgY显著增强,但低于儿茶素。三种样品均表现出非牛顿假塑型流体特性,静态流变学分析结果表明,表观粘度大小表现为复合物>IgY>儿茶素。通过动态流变学分析结果表明,G’和G″表现为频率依赖性,样品的G’>G″,表明弹性性能占主导地位。复合物G’和G″值高于其余组。流变学结果表明复合物可能具有较高的物理稳定性。(4)通过测定儿茶素-IgY复合物对菌体的最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)、生长曲线、对菌体核酸蛋白质泄露情况及荧光倒置显微镜观察菌体整体形态探究复合物的抑菌效果及抑菌机制。结果表明:儿茶素-IgY复合物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的MIC分别为0.5 mg/m L及0.125 mg/m L,MBC分别为2 mg/m L及1 mg/m L。生长曲线结果表明:儿茶素-IgY复合物可以抑制菌体的生长,对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好。核酸蛋白质泄露测定结果表明:儿茶素-IgY复合物可以通过破坏菌体的细胞膜,导致胞内遗传物质的泄露,从而抑制菌体的生长,并且对菌体的破坏作用具有浓度依赖性。倒置荧光显微镜结果表明:复合物可以使菌体细胞膜受损,有效抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的生长,并最终导致菌体死亡。进一步验证了上述结果。
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