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漆酶(laccase,EC 1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶,作用底物包括酚类、芳胺类、羧酸类、甾体激素和生物色素等。其不仅在木质素的降解和制浆造纸中有重要的应用前景,在废水处理、生物漂白、环境污染物降解、土壤修复、生物监测、食品加工和有机合成等方面也具有潜在的应用价值。本文中用密码子最适化方法合成一个全长1338 bp的漆酶基因,并命名为lac1338。采用大肠杆菌表达系统对该基因高效表达,研究其重组蛋白的酶学性质和在降解环境污染物方面的应用。此外,为了提高该漆酶的酶活性及对环境污染物的降解能力,利用易错PCR技术对该基因进行分子改造。主要研究结果如下:通过密码子最适化方法合成了一个漆酶基因lac1338,该基因序列全长1338bp,编码445个氨基酸残基,推测其分子量为50 k Da。将该漆酶基因lac1338连接到p ET-32a(+)表达载体上,并转入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中,使用终浓度为0.2 mmol/L IPTG及0.5 mmol/L Cu SO4,30°C诱导16 h,蛋白表达量达到最高,为450 mg/L。纯化后的重组漆酶Lac1338为单一的条带,分子量约为67 k Da,与理论预测蛋白分子量相同。根据蛋白标准曲线计算得纯化后的Lac1338的浓度为0.25 mg/ml,酶活测定显示纯化后的Lac1338酶活为5.7 U/ml,比酶活即为22.8 U/mg。酶学性质研究表明,Lac1338的最适反应温度为55°C,在35°C-50°C经2h处理,酶活仍保持70%以上;Lac1338的最适p H为6.0,且在p H 4~8之间经4 h的处理仍然保存50%以上的酶活。总体上,Lac1338有很好的p H稳定性和热稳定性,能够在高温下发挥相对高的酶催化活力。根据Michaelis-Menten方程v=Vmax·[s]/Km+[s]的变形方程1/v=Km/Vmax·1/[s]+1/Vmax,通过双倒数作图法,测得反应以ABTS为底物时的Km和Vmax分别为567μmol/L和2.8 mmol/(min·g protein)。研究了Lac1338对6种染料的降解效果,添加Ca2+时能有效促进Lac1338对染料的降解能力;同时添加Ca2+和小分子介体ABTS时,其对染料降解能力得到进一步增强,对刚果红及靛蓝的降解率达95%以上,对溴酚蓝及考马斯亮蓝有20%的降解率,对酸性紫7有10%的降解率。研究表明,Lac1338比酶活活性较低,因此采用定向进化技术对其进行分子改造。利用易错PCR方法构建突变文库,以对ABTS的酶活力为筛选指标,最终获得酶活性提高的突变酶Lac2-9。Lac2-9有7个碱基突变,3个为同义突变:T243C/T267C/T552A;4个错义突变:T842C/C926T/A952G/T698A,相应的氨基酸变化为:V281A/P309L/S318G/D232V。与野生型漆酶相比,突变酶的酶活性提高了3.5倍(79.8 U/mg,以ABTS为底物);最适反应温度提高了5°C,达到60°C,其最适反应p H值从6.0提高到6.5(以ABTS为底物);温度稳定性有所改善,在55°C下保温4 h剩余酶活力从30%提高到50%以上,但p H稳定性未见有明显改善。染料降解率研究发现,突变株Lac2-9对酸性紫7、溴酚蓝、考马斯亮蓝、苋菜红的降解率分别由10.9%、20%、25%、13.7%升高到90.5%、67.8%、85%、14.5%。上述结果表明,在提高漆酶活力和环境污染物降解能力上,易错PCR技术是一种行之有效的方法。利用响应面方法对突变酶的表达条件进行优化,优化后突变酶的表达量比未优化前(450 mg/L)提高了22.22%,达550 mg/L。本研究为今后进一步研究和改造漆酶,并进行工业化生产奠定了一定的基础。