白桦BpbHLH112基因调控白桦抗旱耐盐功能研究

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转录因子bHLH(basic helix-loop-helix)家族广泛存在于真核生物中。植物bHLH家族成员众多、参与的生物过程复杂。一些研究发现,bHLHs在调控植物生长和逆境胁迫响应过程中发挥着重要作用。本研究组在前期白桦转录组分析中获得一个应答盐胁迫的bHLH转录因子基因BpbHLH112,本研究对其表达特性和功能进行了分析,研究结果如下:(1)从白桦中克隆了BpbHLH112基因,该基因c DNA全长为1431 bp,编码一个含有476个氨基酸残基的蛋白质,相对分子量约为52 KD,理论等电点为5.78。通过预测保守结构域和多序列比对发现BpbHLH112蛋白属于bHLH家族蛋白。(2)BpbHLH112基因的表达模式研究结果表明BpbHLH112基因在白桦的根、茎、叶和芽中均有表达。此外,BpbHLH112基因在Na Cl、PEG和ABA胁迫处理后表达量均升高,表明BpbHLH112基因能够响应多种逆境胁迫。(3)将BpbHLH112与GFP报告基因融合并瞬时转化烟草,亚细胞定位观察表明,BpbHLH112蛋白定位在细胞核中。转录激活活性检测证明BpbHLH112转录因子具有转录激活活性,其转录激活区在N端1~117氨基酸内。(4)通过PCR技术,克隆了1446bp长的启动子片段。序列分析显示,该启动子区域含有多个干旱和盐胁迫响应元件以及多个激素响应元件。将BpbHLH112基因启动子与GUS报告基因融合并瞬时转化白桦幼苗,GUS表达特性分析发现,BpbHLH112基因启动子能够驱动GUS基因在白桦幼苗的根、茎、叶和芽中表达。进一步将克隆的BpbHLH112启动子4种长度的5’缺失片段和GUS报告基因融合后瞬时转化烟草,GUS组织化学染色以及GUS酶活测定结果表明,BpbHLH112启动子的盐胁迫正调控区域为-347至+55,干旱胁迫正调控区域为-1446至-1031,ABA胁迫正调控区域为-634至-347,证明BpbHLH112基因启动子能调控多种逆境胁迫,为胁迫诱导型启动子。(5)构建BpbHLH112基因过表达载体并转入拟南芥,获得11个转基因拟南芥纯合株系。分别用Na Cl和甘露醇对转基因拟南芥进行胁迫处理,结果发现转基因株系的成苗长势明显好于野生型,发芽率、根长等生长指标以及SOD和POD活性、脯氨酸和叶绿素含量均高于野生型株系,而丙二醛和过氧化氢含量则低于WT,以上结果表明转BpbHLH112拟南芥株系的抗旱耐盐性高于未转基因株系。(6)为进一步研究验证BpbHLH112基因在植物应对干旱和盐胁迫中的作用,利用叶盘法转基因技术创制了9个过表达BpbHLH112基因白桦株系。分别用Na Cl或甘露醇对过表达株系及野生型进行胁迫处理后,发现过表达BpbHLH112基因白桦株系的SOD、POD活性、脯氨酸、叶绿素含量都高于野生型株系,而MDA、H2O2和O2-积累程度更轻,表明过表达BpbHLH112基因提高了白桦清除活性氧的能力,进而增强了转基因白桦的抗旱耐盐能力。综上所述,BpbHLH112作为一个bHLH转录因子基因能在拟南芥和白桦幼苗的抗旱耐盐性中起正调控作用,这为通过转基因技术提高植物抗旱耐盐性提供理论参考。
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