【摘 要】
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[目的]课题组在前期研究发现肺癌组织中存在微生物,探讨大肠杆菌（E.coli）对肺上皮细胞MUC16表达影响及调控机制。[方法]1.建立细胞菌株共培养体系:将肺腺癌细胞NCI-H1734、肺鳞癌细胞SK-MES-1和正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B扩增传代后分别与大肠杆菌标准菌株 ATCC25922、敲除 dgcQ 基因的 ATCC25922 菌株（ATCC25922ΔdgcQ）、敲除 dgcE
【基金项目】
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国家自然科学基金（82060426）:LINC00842调控MUC16与TERT表达在云南宣威家族肺癌遗传易感中的作用及机制研究； 国家自然科学基金（81960335）:大肠杆菌运动与触觉调控在生物材料植入感染中的作用及机制研究； 云南省卫生科技计划（2018NS0081）:不同粒径二氧化硅与3,4-苯并芘在云南宣威女性肺
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[目的]课题组在前期研究发现肺癌组织中存在微生物,探讨大肠杆菌（E.coli）对肺上皮细胞MUC16表达影响及调控机制。[方法]1.建立细胞菌株共培养体系:将肺腺癌细胞NCI-H1734、肺鳞癌细胞SK-MES-1和正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B扩增传代后分别与大肠杆菌标准菌株 ATCC25922、敲除 dgcQ 基因的 ATCC25922 菌株（ATCC25922ΔdgcQ）、敲除 dgcE基因的ATCC25922菌株（ATCC25922ΔdgcE）共培养。在共培养4h、8h和15h时,观察细胞菌株共培养条件下细胞形态和群体密度变化。2.细胞与菌株共培养4h、8h和15h时,取各组细胞菌株共培养体系,用中性甲醛固定,再用伊红和Hoechst 33258染液染色后拍摄荧光照片,观察细胞胞质蛋白和核内DNA状态。3.细胞与菌株共培养4h、8h和15h时,用qRT-PCR检测细胞MUC16基因、管家基因（GAPD、ACTB、UBC、TBP、SDHA、HPRT1、YWHAZ）及相关基因（LINC00842、MNT、MAX、MAZ、DACH1、TERT）表达情况。4.聚类分析与MUC16基因变化规律相似的调控基因或相关基因。[结果]1.各菌株单独培养时状态差异不同菌株生长情况差异:ATCC25922生长最快,8h、15h菌株密度最高;ATCC25922ΔdgcQ生长最慢,8h、15h菌株密度最低;三者中ATCC25922ΔdgcE生长速度居中,8h和15h菌株密度均居中。2.细胞菌株共培养条件下细胞形态和群体密度变化1)肺支气管上皮细胞BEAS-2B和大肠杆菌共培养加入菌株的BEAS-2B细胞整体死亡率（10%～20%）不高,存活的细胞圆缩变小,有相互粘连现象,整体表现出优于肺癌细胞（NCI-H1734、SK-MES-1）的耐受力。菌株杀伤力比较:ATCC25922菌株对BEAS-2B细胞的杀伤力最强、ATCC25922ΔdgcQ菌株对细胞的杀伤力最低、ATCC25922ΔdgcE菌株对细胞的杀伤力居中。2)肺腺癌细胞NCI-H1734与大肠杆菌共培养加入菌株的NCI-H1734细胞整体耐受力相比其他两种细胞居中:肺腺癌细胞NCI-H1734死亡率（50%～85%）高于正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B（10%～20%）,但低于肺鳞癌细胞SK-MES-1（70%～90%）。菌株杀伤力比较:ATCC25922菌株对NCI-H1734细胞的杀伤力居中、ATCC25922ΔdgcQ菌株对NCI-H1734细胞的杀伤力最高、ATCC25922ΔdgcE菌株对NCI-H1734细胞的杀伤力最低。3)肺鳞癌细胞SK-MES-1与大肠杆菌共培养加入菌株的SK-MES-1细胞死亡率（70%～90%）在3株细胞中最高,15h时细菌增殖最为明显,整体与其他两种细胞（BEAS-2B、NCI-H1734）相比耐受力最低。菌株杀伤力比较:ATCC25922对SK-MES-1细胞的杀伤力最强、ATCC25922ΔdgcQ菌株对细胞的杀伤力居中、ATCC25922ΔdgcE菌株对细胞的杀伤力最低。3.细胞菌株共培养条件下细胞关键基因表达的变化1)肺上皮细胞和大肠杆菌共培养MUC16基因变化加入大肠杆菌后BEAS-2B细胞内MUC16基因在各时间点均显著升高,较单独培养时高3到5倍;NCI-H1734细胞MUC16基因在各时间点均显著升高,较单独培养时高4到7倍;SK-MES-1细胞MUC16基因在4h稍低于单独培养时;8h和15h时显著升高,较单独培养时高4到5倍。2)细胞MUC16调控基因及其相关基因在共培养条件下的表达变化MUC16在共培养体系呈现和TERT的趋势相似。在肺上皮细胞BEAS-2B组的共培养体系中:MUC16和TERT的共同上游转录因子,4h以MAZ、MAX为主,8h以MAX、MNT、DACH1为主,15h则以MNT为主。在不同分组条件下LINC00842和DACH1、MNT、MAZ的变化规律接近肺腺癌细胞NCI-H1734组的共培养体系中:MUC16和TERT的共同上游转录因子,4h以MAZ、MAX为主,8h以MAZ、DACH1为主,15h则以MAZ为主。在不同分组条件下LINC00842和MAZ、DACH1的变化规律接近。[结论]1.大肠杆菌dgcQ与dgcE基因可影响菌株的生长速度和运动能力。2.大肠杆菌（标准株 ATCC25922、ATCC25922ΔdgcQ、ATCC25922ΔdgcE）与肺上皮细胞（BEAS-2B、NCI-H1734、SK-MES-1）共培养过程中,正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B对大肠杆菌耐受能力最强,肺腺癌细胞NCI-H1734次之,肺鳞癌细胞SK-MES-1最差。3.大肠杆菌与肺上皮细胞（BEAS-2B、NCI-H1734、SK-MES-1）共培养过程中,MUC16表达上调趋势明显,以肺腺癌细胞NCI-H1734中上调最为显著。4.肺腺癌细胞NCI-H1734组的共培养体系中,MUC16和TERT变化规律相似,可能通过调节MAZ、DACH1进而调控MUC16。
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