结直肠癌(CRC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一。居世界恶性肿瘤发病和致死的第三、四位,发病率约为7/100000,每年大约有5000新发病例和3200死亡病例。因此。CRC是每年肿瘤发病率和死亡率的主要原因。目前,手术和术后结直肠癌的化疗仍是治疗CRC的一种有效方法。但它的副反应导致生活质量严重下降。中药及其有效成分预防和治疗肿瘤的作用与化学药物相比有很多优势。近年来世界对中药的接受度逐渐提高,利用现代化手段提取中药中有独特生物活性的物质,对我国药物研发和医药产业的可持续发展具有十分重要的意义。中药及其有效成分的抗肿瘤作用研究在世界范围内已成为热点研究课题。研究发现中药抗肿瘤的作用机制主要有以下几个方面(1)影响肿瘤细胞增殖动力学和细胞周期(2)诱导肿瘤细胞凋亡(3)调控基因表达及抗诱变作用(4)抑瘤及抗转移(5)免疫调节。因此,寻找高效、低毒防治结直肠癌复发和转移的药物是目前CRC治疗中迫切需要解决的问题。中药苦豆子(Sophora Alopecuraides, L.)为豆科(Legum inosae)槐属多年生草本植物。广泛分布于我国西北华北荒漠地区,性味苦寒,具有清热燥湿、止痛杀虫等作用。现代药理研究表明其具有抗炎、提高免疫力、中枢神经镇静等作用。目前发现,苦豆子中含有丰富的喹诺里西丁(Quinlizidine)类生物碱,此类生物碱均为含氮的有机碱化合物,具有明显的抗癌作用,是近年抗肿瘤药物研究重点之一,其中苦参类生物碱如苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱等之前已有抗肿瘤的多种报道。本课题组在研究中发现,苦豆子总生物碱对溃疡性结肠炎具有良好治疗作用,苦豆碱对结直肠癌亦有较好抑制作用。由于溃疡性结肠炎与CRC具有显著相关性,因此本课题拟对苦豆子中的苦豆碱(ALO)进行抗结直肠癌的研究,观察其体外作用及作用机制。苦豆子中主要化学成分包括生物碱、黄酮类、有机酸、氨基酸、蛋白质和多糖类等,其它还有脂肪酸及无机元素等。目前用于药物开发的生物碱主要有8种：苦参碱(matrine, MT),氧化苦参碱(oxymatrinel, OMT),槐果碱(sophocarpine, SC),氧化槐果碱(oxysophocarpine, OSC),槐胺碱(sophoramine, SA),槐定碱(sophoridine, SRI),莱曼碱(1ehmannine, LEH),苦豆碱(aloperine, ALO)。目的本课题通过ALO对不同结肠癌细胞株的抑制作用,初步筛选出对苦豆碱敏感的细胞株,针对苦豆碱作用的特点,结合分子生物学理论探讨其抗结肠癌的作用机制。方法1.苦豆碱对结肠癌细胞株抑制作用的初步筛选。采用MTT法检测苦豆碱,槐定碱,苦参碱,野靛碱,氧化苦参碱,槐果碱对结肠癌细胞株SW620的抑制作用,以及苦豆碱对结肠癌细胞株SW620、DLD1、HCT116、HT29和174t的抑制作用。2.苦豆碱对结肠肠癌SW620细胞周期的影响。流式细胞术检测苦豆碱对SW620细胞周期的改变,免疫印迹法检测细胞周期调控蛋白p16, CDK4, cyclinD1,Rb,phosphor-Rb (Ser780)的水平,实时荧光定量PCR检测其mRNA水平。3.苦豆碱对结肠癌细胞SW620凋亡作用的影响。采用HE染色法,Hoechst33258及PI染色法观察细胞形态学的改变。流式细胞术检测苦豆碱作用SW620后细胞凋亡的变化及细胞线粒体膜电位的影响,试剂盒检测氧化活性因子(超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX和丙二醛MDA)的改变。免疫印迹法检测细胞凋亡调控蛋白Bcl-2,Bax,caspase3,caspase9,PARP蛋白的水平,实时荧光定量PCR检测bcl-2及Bax mRNA水平的变化。4.苦豆碱作用SW620后,Akt通路的影响。采用免疫印迹法检测Akt及p-Akt(Ser473), p-Akt(Thr308)水平的变化。结果1.MTT法检测苦豆碱对结肠癌SW620细胞生长的影响：与其他六种生物碱比较,苦豆碱对SW620细胞株有明显增殖抑制作用；SW620细胞生长增殖抑制率随着时间和浓度的增加而增加,呈一定的时间,剂量依赖性关系。对苦豆碱作用24、48、72h的抑制率进行Probit回归分析,结果显示其IC50为1.767+0.016mM、1.218±0.032mM及1.021±0.092mM,同时检测苦豆碱对SW620、DLD1、 HCT116、HT29和174t抑制作用,研究发现与DLD1、HCT116、HT29和174t比较,苦豆碱对SW620的ICso较小,提示SW620对苦豆碱的抑制作用比较敏感。2.ALO对SW620细胞周期的影响：流式细胞术检测结果显示：ALO可以明显将细胞阻滞在G0/G1期,Western Bloting结果显示细胞周期调控蛋白p16,cyclinD1,phosphor-Rb (Ser780)与对照组比较显著增加,CDK4水平明显低于对照组。3.ALO对SW20细胞凋亡的影响：细胞形态学及凋亡相关蛋白的改变：H.E.染色、Hoechst33258染色、PI染色法观察ALO体外抑制结肠癌细胞株SW620增殖及诱导其产生凋亡的作用。细胞体积明显缩小,胞浆皱缩、核固缩、染色质边聚。Western Bloting结果表明给药组中细胞凋亡调控蛋白Bcl-2,caspase3, caspase9,PARP蛋白的水平下调,与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。给药组中Bax的水平与对照组比较显著升高。提示ALO诱导SW620细胞凋亡可能与调控蛋白Bcl-2,caspase3,caspase9,PARP,Bax有关。流式细胞术结果表明ALO可升高SW620的线粒体膜电位,与对照组比较有显著性差异。流式细胞术结果表明与对照组比较,ALO组细胞膜内外电位比值分别达22.32±1.93%,37.45±2.10%,55.43±4.81%与阴性对照组比较具有显著性差异(P<0.01)。4.ALO对SW620细胞Akt通路的影响：实验结果显示ALO组中,p-Akt(Ser473)和p-Akt(Thr308)蛋白水平低于对照组,有统计学差异(P<0.05)。提示ALO抑制结肠癌细胞株SW620的作用机制可能是通过抑制Akt调控点实现的。结论ALO通过阻滞SW620细胞于G0/G1期并诱导其产生凋亡发挥抗结直肠癌细胞株SW620的作用,这可能与Akt信号通路的抑制有关。