背景与目的：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML),在我国占全部白血病的60%,是由于造血干／祖细胞发育过程中调控因子失常、细胞分化受阻、增殖失控而引起,目前的治疗以化疗为主。虽然有60-80%的患者可获得完全缓解(complete remission, CR)并延长生存期,但仍有20%-40%的初诊患者根本不能获得完全缓解,即使获得缓解者,其中还有40%-60%患者复发并演变成难治性白血病(refractory leukemia)。白血病细胞多药耐药(multidrug resistance, MDR)仍为当今血液肿瘤治疗中的一大难题,近来认为基因水平异常而导致信号传导通路激活、细胞信号调控网络失衡,是白血病细胞耐药的重要机制。研究发现在白血病耐药过程中多个细胞信号传导通路激活,其中目前研究较多的通路为IGF-1R/PI3K/Akt通路、RAS/RAF/MEK/ERK通路、泛素-蛋白酶体通路等。HL-60/ADM细胞是公认的急性髓系白血病多药耐药细胞株,我们前期研究证明蛋白酶体抑制剂Bortezomib联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589作用于HL-60/ADM细胞和难治性AML原代细胞具有协同抑制增殖及诱导凋亡作用,并能明显下调多药耐药蛋白(multidrug resistance-associated protein-1, MRPI)的表达,提高细胞内阿霉素摄取率,逆转阿霉素耐药并降低PI3K/Akt/NF-KB信号通路的活性。随后通过细胞生物信息学深度分析整合发现,难治性与非难治性AML-M2a的原代细胞基因谱表达差异显著,难治性／AML-M2a发生发展受一极其复杂的生物信号传导网络调控,其中Sonci hedgehog通路很可能是其中的上游通路,并对其它信号通路起调节作用。哺乳动物体内Sonic hedgehog蛋白质家族有三个成员,分别为Shh(Sonic hedgehog、Ihh(Indian hedgehog)、Dhh (Desert hedgehog),其中Shh表达最为广泛,与多种器官的发育形成有关,主要由信号分子Shh、膜受体patched (Ptch)、 smoothened(Smo)、一些中间传递分子和核转录因子Glis组成。该通路在胚胎发育、维持内环境稳定及组织损伤后的修复和再生中起重要作用。其异常激活能导致多种肿瘤如基底细胞癌、髓母细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌等的形成。血液系统疾病中已证实该通路和慢性粒细胞白血病(CML)干细胞的增殖、CD34+白血病细胞的耐药及淋巴瘤、多发性骨髓瘤相关。但该通路和难治性AML的关系、是否可以逆转难治性AML耐药及与其它信号通路的关系尚无研究。本课题拟研究Shh通路在难治性AML原代细胞及细胞株中的表达情况及其与临床预后的关系、通路阻断剂NVP-LDE225作用于HL-60/ADM细胞的抑制增殖、诱导凋亡及逆转耐药作用机制,从而试图剖析Shh通路在难治性AML发生发展中的分子作用机制,为寻求早期诊断难治性AML的指标、新的治疗靶点及有效防治难治性AML的提供依据。研究对象与方法：1、Shh通路表达的检测：①选择HL60细胞、对应多药耐药细胞HL60/ADM及35例难治性AML和38例非难治AML患者骨髓的单个核细胞,QRT-PCR检测细胞株和其中19例难治性AML、23例非难治性AML单个核细胞中Shh通路组分Gli-1、Ptch、Smo基因的表达情况。②提取细胞株及原代细胞蛋白,Western blot方法检测细胞株及其余16例难治性AML和15例非难治性AML中Shh通路Ptch. Smo、Gli-1蛋白水平的表达情况,分析它们在难治性与非难治性AML中的差异性表达及与治疗反应、临床预后的关系。2、将HL60及HL60/ADM细胞培养于含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基中,阿霉素(ADM)单药分别作用于HL60、HL60/ADM细胞,应用MTT法计算增殖抑制率,以24h阿霉素IC50值比较HL-60/ADM和HL-60细胞对阿霉素的敏感性,耐药倍数大于30倍定义为细胞耐药。后以不同浓度NVP-LDE225药物处理细胞,选择无明显抑制增殖作用的浓度,将HL-60/ADM细胞分为ADM、 DNR、Ara-C、HHT单药处理组、NVP-LDE225联合化疗药物处理组,HL-60细胞分为ADM处理组、NVP-LDE225联合ADM处理组,均设置空白对照组。各组均用MTT法检测细胞增殖,以48hADM单药IC50值除以ADM联合NVP-LDE225-10μM后的IC50值,即为逆转耐药倍数。3、NVP-LDE225单药不同浓度作用于HL60/ADM细胞48h, AnnexinV-FITC/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡,及48h后加入ADM0.5μg/ml处理1h后应用流式细胞仪检测HL-60/ADM细胞内阿霉素摄取率。并提取药物处理HL60/ADM细胞后的总蛋白,Western Blot检测MRP1、IGF-1R、p-IGF-1R、 IRS-1、Akt、p-Akt、Gli-1、Bcl-2,探讨Shh通路对IGF-1R/PI3K/Akt通路的调节作用。4、选择难治性AML患者新鲜骨髓的单个核细胞,无菌条件下淋巴细胞分离液分离单个核细胞,分为NVP-LDE225单药组、ADM单药组、NVP-LDE225-10μM联合ADM处理组,MTT法检测细胞增殖,计算逆转耐药倍数。并用流式细胞仪检测NVP-LDE225不同浓度处理48h后的原代细胞凋亡和阿霉素摄取率,Western Blot方法检测药物处理后细胞表面MRP1蛋白的变化。5、选择协同作用最强的浓度21nM LBH589联合12nM Bortezomib(前期研究结果)作用于HL60/ADM细胞48h,Western blot检测Shh通路蛋白Gli-1及IGF-1R蛋白的变化。6、利用SPSS13.0软件进行统计学分析。两组计量资料比较用两独立样本t检验,非正态分布数据以中位数表示,正态分布数据以均数士标准差描述。两组率的比较采用卡方检验。采用Kaplan-Meier法评估患者无复发生存时间(relapse-free survival, RFS)及总生存时间(overall survival, OS)。多组均数比较用单因素方差分析,Levene检验方差齐性,若方差齐使用LSD方法进行多重比较,若方差不齐则使用采用近似F检验(Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett’s T3方法进行多重比较。以p<0.05认为具有统计学差异。结果：1、与HL60细胞比较,多药耐药细胞HL60/ADM在基因及蛋白水平均高表达Shh通路。在19例难治性AML和23例非难治性AML中,QRT-PCR检测基因mRNA表达水平显示,Gli-1、Smo、Ptch在难治性AML的相对表达量分别为0.050(0.011～1.168)、0.108(0.011～3.589)和0.130(0.009～2.916),而在非难治性AML的相对表达量分别为0.025(0.004～0.099)、0.039(0.002～0.306)和0.036(0.005～0.367)。两样本t检验结果提示：P值分别为0.031、0.018、0.043,难治性AML三种基因的表达量均高于非难治性AML。Western blot检测16例难治复发AML中,共有13例表达Gli-1,而在15例非难治性AML中,仅有4例表达Gli-1,表达率分别为81.3%和26.7%,卡方检验结果提示P=0.002,提示难治性AML中激活率高于非难治性AML。分析31例原代AML细胞Gli-1表达情况对临床治疗反应及长期生存的影响,Gli-1高表达组17例,难治性AML占13例(76.5%),非难治性AML占4例(23.5%),≤2个疗程CR者10例(58.8%),大于2个疗程CR或NR者7例(41.2%),CR后一年内复发或多次复发者7例(41.2%),CR后一年后复发或无复发占10例(58.8%)：低表达14例,难治性AML占3例(21.4%),非难治性AML占11例(78.6%),≤2个疗程CR者11例(78.6%),大于2个疗程CR或NR者3例(21.4%),CR后一年内复发或多次复发者1例(7.1%),CR后一年后复发或无复发占13例(92.9%);卡方检验提示：Gli-1的表达对患者CR率无显著影响(P=0.242),对是否发生难治性AML及一年内复发或多次复发具有显著影响(P=0.002和0.031)。高表达Gli-1的患者的中位RFS分别为4.75、6.5个月；低表达Gli-1的患者的中位RFS、OS分别为14、15个月。高表达Gli-1和低表达Gli-1的RFS和OS均有统计学差异(P<0.05)。2、MTT法检测阿霉素敏感性显示：阿霉素作用于HL60/ADM细胞的IC50值约为6.833μg/ml,作用于HL60细胞的IC50值仅为0.086μg/ml, HL60/ADM细胞耐药倍数为HL60细胞的79倍,说明HL60/ADM细胞对阿霉素高度耐药,可以作为下一步研究的细胞模型。对HL60及HL60/ADM细胞,NVP-LDE225剂量为0-10μM范围内细胞增殖率均大于80%,无明显抑制细胞增殖作用,浓度大于20gM时细胞存活率明显下降。选择对细胞无明显抑制增殖作用的浓度10μM分别联合不同浓度的ADM、Ara-C、DNR、HHT化疗药物共同作用。阿霉素单独作用于HL60/ADM细胞株的IC50为0.061μg/ml,联合NVP-LDE225-10μM后IC50为0.016μg/ml,逆转倍数为3.75倍；柔红霉素单独作用于HL60/ADM细胞株的IC50为0.213μg/ml,联合NVP-LDE225-10μM后IC50为0.04μg/ml,逆转倍数为5.08倍。高三尖杉酯碱单独作用于HL60/ADM细胞株的IC50为0.024μg/ml,联合NVP-LDE225-10μM后IC50为0.011μg/ml,逆转倍数为2.18倍。阿糖胞苷单独作用于HL60/ADM细胞株的IC50为40.8μg/ml,联合NVP-LDE225-10nM后IC50为0.17μg/ml,逆转倍数为234倍。阿霉素单独作用于HL60细胞株的IC50为0.00331μg/ml,联合NVP-LDE225后IC50为0.0031μg/ml。两样本t检验结果提示：NVP-LDE225-10μM可以逆转HL60/ADM细胞对ADM、DNR、HHT、Ara-C的耐药性(P值均小于0.05)。而在HL60细胞中无此现象(P=0.692)。3、不同浓度NVP-LDE225处理HL60/ADM细胞48h,流式细胞仪检测发现对照组细胞总凋亡率为4.52±1.29%,5μM、10μM和20μM NVP-LDE225处理HL60/ADM细胞总凋亡率分别为6.17±1.73%、11.82±4.21%、52.41±10.57%。单因素方差分析结果显示,不同药物浓度处理HL60/ADM细胞48h细胞总凋亡率之间存在统计学差异(F=46.010; P=0.007)。 Dunnett T3法多重比较分析显示,和对照组及低浓度的NVP-LDE225处理组(5μM、10μM)相比,随着药物浓度的增加,高浓度的NVP-LDE225(20μm)处理组细胞总凋亡率显著增加,P值均小于0.05。HL-60/ADM细胞加入不同浓度NVP-LDE225处理48h后,再加入阿霉素终浓度为0.5μg/ml,继续培养1h后流式细胞仪检测细胞内阿霉素荧光阳性率,单因素方差分析显示,对照组、不同药物浓度处理组阿霉素阳性率之间有显著性差异(F=306.924, P=0.000)。 LSD法多重比较分析显示,5μM NVP-LDE225处理组和10μM NVP-LDE225组分别为65.89±3.93%、70.58±4.71%,均显著高于单药组3.32±1.93%(P=0.000)。提取NVP-LDE225不同浓度处理后的蛋白行Western blot检测,随着NVP-LDE225浓度的增加,细胞表面MRP1表达量逐渐下降。Western blot检测HL-60/ADM细胞经过不同浓度NVP-LDE225处理后的蛋白变化显示,对照组及药物不同浓度处理组IGF-1R、Akt总蛋白水平保持不变,而不同组p-IGF-1R、IRS-1、p-Akt、Bcl-2、Gli-1表达水平存在显著性差异。随着NVP-LDE225浓度的增加,细胞内上述蛋白表达量逐渐下降。4、原代细胞实验：阿霉素单独作用于难治性AML原代细胞株的IC50为0.0426±0.0013μg/ml,联合NVP-LDE225-10μM后IC50为0.0119±0.0007μg/ml,逆转倍数为3.58倍。两样本t检验显示,P值为0.000,具有显著差异。不同浓度NVP-LDE225处理难治性AML原代细胞48h,流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示：对照组细胞凋亡率为21.67±3.06%,5μM、10μM和20μM NVP-LDE225处理原代细胞总凋亡率分别为33.23±1.08%、48.2±2.03%、66.03±4.00%。单因素方差分析结果显示,不同药物浓度处理原代细胞48h细胞总凋亡率间存在统计学差异(F=144.483；P=0.000)。LSD法多重比较分析显示,随着药物浓度的增加,不同处理组细胞总凋亡率显著增加,P值均小于0.05。原代细胞加入不同浓度NVP-LDE225处理48h后,再加入阿霉素终浓度为0.5μg/ml,继续培养1h后流式细胞仪检测细胞内荧光阳性率,单因素方差分析显示,对照组、不同药物浓度处理组阿霉素阳性率之间有显著性差异(F=174.347,P=0.000)。LSD法多重比较分析显示,5μM、10μM、20μM NVP-LDE225处理组分别为16.2±1.68%、25.05±1.78%、42.91±2.72%,均显著高于单药组(4.697±2.12%)(P=0.000)。LSD法多重比较分析显示,随着药物浓度的增加,不同处理组细胞阿霉素摄取率明显增加,P值均小于0.05。提取NVP-LDE225不同浓度处理后的蛋白行Western blot检测,随着NVP-LDE225浓度的增加,细胞表面MRP1表达量逐渐下降。5、Bor联合LBH589可以显著下调p-IGF-1R、Gli-1蛋白表达量,验证课题组此前研究结果,提示二者作用靶点在上游Shh通路。结论：1、和非耐药细胞株HL60及非难治性AML原代细胞相比,耐药珠HL60/ADM及难治性AML原代细胞中存在Shh信号通路的高表达。且高表达该通路的AML患者难治性AML及短期复发或多次复发发生率高,且RFS及OS均低于低表达者。2、Shh通路阻断剂NVP-LDE225单药-10μM可以逆转HL60/ADM细胞株对ADM、DNR、HHT、Ara-C的耐药,逆转倍数分别为3.75、5.08、2.18、234倍。随着NVP-LDE225药物浓度的增加,HL60/ADM细胞的凋亡率及阿霉素摄取率均逐渐增加。其机制可能是通过下调细胞内p-IGF-1R、IRS-1、p-Akt、Gli-1、 MRP1蛋白的表达而起到逆转耐药的作用。如此也在难治性原代AML细胞中得到了验证。3、Bor联合LBH589可通过降低Shh通路表达从而抑制IGF-1R/PI3K/Akt通路起到逆转耐药等作用,可能存在的作用机制如下图。