心肌缺血-再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,I/R injury）是由于动脉粥样硬化、血栓或冠状动脉痉挛所致的急性心肌供血不足后,在一定时间条件下进行再灌注治疗过程中产生了大量活性氧产物（Reactive Oxygen Species,ROS）,导致不同程度的心肌损害。缺血-再灌注损伤是一种复杂的病理生理过程,受多种因素所调控。正常情况下,低浓度的ROS可以调节血管细胞的功能,但过度氧化应激导致活性氧簇的蓄积,当这种蓄积超过了机体抗氧化防御的能力,就会造成组织细胞损伤,引起基因突变、细胞死亡、蛋白质变性、脂质过氧化、细胞膜结构破坏等,从而引起了一系列的生理生化紊乱。在心肌缺血再灌注损伤中,氧化应激损伤会导致各种类型的细胞损伤包括坏死、凋亡和自噬。其中细胞凋亡一直以来都是生物学研究热点,而细胞自噬在氧化应激损伤中的作用也逐渐被人们所重视。自噬通过清除细胞内受损、衰老的大分子蛋白质以及细胞器发挥其生理作用。而氧化应激及过多的活性氧产物（ROS）是自噬的重要刺激因素。Micro RNA（miRNA）是一类只有20-25个核苷酸长度的微小的非编码的RNA序列,近20年关于miRNA的相关研究层出不穷,是目前生物学研究领域的热点话题。MiRNA的生物学效应非常广泛,它能够调节细胞生物学的各个方面,包括细胞分化、增殖、血管发生及凋亡等。心脏及血管的生理及病理生理也受其调节,其中,miRNA-210被认为是体内最主要的缺氧相关性miRNA,无论在正常细胞中或肿瘤细胞的缺氧反应过程中,mi R-210的上调都作为一个持续性特征而存在,并从多个方面调节心血管疾病的发生与发展。近期的研究发现miRNA-210不仅仅通过多种途径参与细胞凋亡的调控,还可能参与调控细胞自噬过程。而在缺氧过程中也多伴随着不同程度的氧化应激损伤。由此本实验提出如下假设:miRNA-210可能参与了细胞氧化应激损伤过程中细胞凋亡和自噬的发生及发展。MiR-210通过抑制特定靶基因m RNAs的蛋白质翻译,或促进相应靶基因的m RNAs的降解,来调节靶基因的表达。到目前为止,多个研究已经深入探讨了MiR-210及其靶基因之间的作用关系,常见的靶基因包括e2f3,MNT,Casp8ap2,ephrin-A3,ISCU,COX10,GPD1L and BNIP3,在这些靶基因中,BNIP3（BCL-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3）是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白的一员,并且有多个研究表明BNIP3在细胞的坏死、凋亡乃至自噬过程中发挥重要作用。BNIP3是仅含有BH3结构域的非典型的Bcl-2同源物,定位于线粒体外膜上,参与细胞的死亡、自噬和程序性线粒体清除。BNIP3可以通过调控线粒体活性氧产物的产生从而诱导细胞自噬,或通过解除Beclin-1与抗凋亡蛋白Bcl-2家族的结合来释放Beclin-1,进而诱导细胞自噬。有实验已经证明BNIP3通过抑制m TOR发挥其促细胞自噬的作用,而miRNA-210则被证明能够通过抑制BNIP3从而发挥抗凋亡作用的。本实验利用H₉C₂细胞建立氧化应激模型,以此为研究对象,检测了心肌细胞氧化应激状态下miRNA-210的表达变化,探讨了miRNA-210在氧化应激诱导心肌细胞死亡过程中对凋亡和自噬的影响以及作用机制,同时阐明了BNIP3蛋白在这个过程中所扮演的角色,为心血管疾病的治疗提供新的线索。方法1.利用过氧化氢刺激H₉C₂细胞构建氧化应激损伤的细胞模型,分别用MTT法、LDH检测、Caspase-3活性检测、TUNE染色、DCFH-DA活性氧检测、线粒体膜电位检、超氧化物歧化酶和丙二醛检测、Western blot检测自噬相关蛋白LC3的表达,以及共聚焦显微镜观察细胞LC3点状聚集来反应氧化应激的损伤程度。应用3-MA来抑制自噬,从而观察自噬在心肌细胞氧化应激损伤中的作用。2.利用实时荧光定量PCR检测过氧化氢刺激后细胞mi R-210的表达。构建mi R-210高表达和低表达模型,瞬时转染miRNA-210 mimics及inhibitor质粒,检测细胞凋亡相关指标,Western blot检测细胞自噬相关蛋白LC3的表达,观察自噬在不同mi R-210表达情况下的作用。3.Western blot检测过氧化氢刺激后细胞BNIP3蛋白表达的变化。通过荧光素酶报告基因（luciferase assay）检测mi R-210与BNIP3的关系。瞬时转染miRNA-210 mimics质粒及inhibitor质粒,应用Western blot检测转染后BNIP3蛋白的表达变化。4.构建BNIP3基因敲除模型,采用瞬时转染的方法,将BNIP3的si RNA质粒转染至H₉C₂细胞,并进行过氧化氢处理,利用Western blot方法检测LC3蛋白的表达水平,共聚焦显微镜观察LC3点状聚集。5.构建BNIP3过表达细胞模型,将过表达载体质粒与mi R-210 mimic共同转染至细胞内,Western blot检测BNIP3及LC3的蛋白表达,利用共聚焦显微镜观察LC3点状聚集。结果1.过氧化氢可明显抑制心肌细胞存活率,氧化损伤指标明显增加,线粒体膜电势降低,细胞凋亡水平增高;自噬相关蛋白LC3II表达增加,免疫荧光实验激光共聚焦观察心肌细胞内自噬点明显增多,抑制细胞自噬后细胞存活率明显增多,氧化损伤明显降低。2.过氧化氢能够诱导心肌细胞氧化应激损伤过程中mi R-210的表达水平上调;过表达mi R-210能够减轻过氧化氢诱导的心肌细胞氧化损伤及细胞自噬活化水平;下调mi R-210的表达则加重心肌细胞损伤,但在下调mi R-210过程中抑制自噬能够部分逆转细胞损伤程度,由此推测,mi R-210在心肌细胞氧化应激损伤过程中起到了一定的细胞保护作用,并且这种保护作用可能是部分通过抑制自噬来实现的。3.心肌细胞氧化应激损伤过程中BNIP3的蛋白表达明显上调,并且该种上调呈时间依赖性;荧光素酶报告基因实验结果表明BNIP3是mi R-210的下游靶基因;高表达mi R-210可以抑制BNIP3蛋白表达;利用si RNA抑制BNIP3蛋白表达后,过氧化氢处理后的心肌细胞自噬水平有所下降,这些结果提示了BNIP3参与了过氧化氢诱导的H₉C₂细胞的自噬活化过程。4.实验的最后同时上调mi R-210以及BNIP3的表达水平,发现上调BNIP3的表达后部分抵消了上调mi R-210所带来的抑制自噬活化的作用,提示我们在过氧化氢诱导的H₉C₂细胞氧化应激损伤过程中mi R-210是通过抑制BNIP3的表达来部分发挥抑制自噬活化的作用的。结论1.过氧化氢诱导心肌细胞氧化应激损伤一方面能够触发细胞线粒体途径凋亡,并激活caspase级联反应,另一方面可以诱导细胞自噬活化,抑制自噬后细胞凋亡减少,这也表明活化的自噬对于心肌细胞具有一定的损伤作用,氧化应激损伤心肌细胞可能是通过凋亡和自噬两种途径介导。2.在心肌细胞氧化应激损伤过程中mi R-210的表达水平明显上调,mi R-210作为上游调控因子,参与了氧化应激过程,高表达mi R-210减轻氧化应激诱导的细胞损伤,同时减少了细胞凋亡的发生和细胞自噬的活化,表明mi R-210作为一个抗氧化因子可通过抑制凋亡和自噬从而对心肌细胞起到了一定的保护作用。3.心肌细胞氧化应激损伤过程中细胞自噬的活化可能是通过BNIP3蛋白介导的,mi R-210可以靶向作用于BNIP3,进而抑制细胞自噬活化。创新点及研究意义本研究首次证实了mi R-210可抑制氧化应激所致的细胞自噬水平活化,阐明了mi R-210作为上游因子通过直接抑制其靶基因BNIP3的蛋白表达来发挥细胞保护作用。本研究为心肌细胞氧化应激损伤提供新的实验证据,为mi R-210在心血管疾病中的保护作用提供理论基础,为进一步临床中诊断和治疗提供新的思路。