帕金森症(Parkinson’s disease, PD)是第二大神经退行性疾病,主要病理特点是多巴胺能神经元选择性缺失和路易小体的存在,多巴胺能神经元缺失会导致多巴胺产生和释放减少,从而引起一系列运动和非运动症状,严重威胁着老年人的身体健康和生活质量。PD的发病机制极其复杂,环境和遗传因素都可能导致疾病的发生,氧化应激被认为是PD中神经元退变的重要因素,因此具有抗氧化活性的药物可能会对PD的治疗起到一定积极作用。刺参多糖是刺参体壁中一种重要的活性成分,具有抗肿瘤、抗凝血和免疫调节等多种生物活性。我们实验室前期从鲜刺参体壁中分离纯化得到一种多糖,命名为SJP,前期研究已经证实SJP具有抗缺氧／复氧损伤的作用,并且作用机制可能与抗氧化有关。6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤模型是目前经常用到且比较成熟的体外PD模型。因此,本课题的目的是研究SJP对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用,并对其作用机制进行探讨,从而在体外评估SJP用于PD治疗的可能性。主要研究内容如下：1、研究SJP对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用采用MTT法检测SJP和6-OHDA对细胞存活率的影响,结果显示6-OHDA可显著降低细胞存活率,而SJP能够提高细胞存活率。采用Hoechst33342/PI染色检测细胞的死亡情况,结果显示6-OHDA会促进细胞凋亡与坏死,而SJP可以抑制细胞凋亡与坏死。使用LDH试剂盒检测上清液中LDH水平,结果显示,6-OHDA会升高上清液中LDH释放量,而SJP会抑制LDH的释放。使用ROS和SOD试剂盒分别检测细胞ROS产生水平和SOD活力,结果显示,6-OHDA会升高细胞ROS水平,降低SOD活力,而SJP会降低ROS水平,升高SOD活力。上述结果表明SJP可以抑制6-OHDA诱导的氧化应激和细胞死亡。2、研究SJP保护6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用机制使用JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位的变化情况,结果显示,6-OHDA会降低细胞线粒体膜电位,而SJP会升高线粒体膜电位。采用Western Blot实验检测细胞中Bax、Bcl-2、胞浆cytochrome c、线粒体cytochrome c、procaspase-3、 cleaved caspase-3、procaspase-9以及cleaved caspase-9的蛋白表达水平,结果显不6-OHDA会升高Bax/Bcl-2、胞浆cytochrome c/线粒体cytochrome c、cleaved caspase-3/procaspase-3和cleaved caspase-9/procaspase-9的比值,而SJP会降低上述四种比值,表明SJP会抑制线粒体凋亡途径。采用Western Blot实验检测p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt的蛋白水平,结果显示6-OHDA会升高p-p38/p38、p-JNK/JNK和p-ERK/ERK的比值,降低p-Akt/Akt的比值,而SJP预处理会降低P-p38/p38、p-JNK/JNK的比值,升高p-Akt/Akt的比值,对p-ERK/ERK的比值无影响,表明SJP会抑制p38 MAPK和JNK通路的激活,并抑制PI3K/Akt通路的失活。使用p38、JNK、ERK和Akt抑制剂以及Western Blot实验检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况,结果显示,p38和JNK抑制剂会进一步降低Bax/Bcl-2、胞浆cytochrome c/线粒体cytochrome c、cleaved caspase-3/procaspase-3、cleaved caspase-9/procaspase-9的比值,表明抑制p38和JNK通路会进一步促进SJP的线粒体凋亡抑制作用,而与300 μg/mL SJP组相比,Akt抑制剂处理会升高Bax/Bcl-2、胞浆cytochrome c/线粒体cytochrome C、cleaved caspase-3/procaspase-3、cleaved caspase-9/procaspase-9的比值,表明抑制PI3K/Akt通路会减弱SJP的线粒体凋亡抑制作用。上述结果表明,SJP可以抑制p38 MAPK和JNK通路的激活以及PI3K/Akt通路的失活,进而抑制线粒体凋亡途径,最终发挥神经保护作用。综上所述,SJP可以通过抑制p38 MAPK和JNK通路的激活以及PI3K/Akt通路的失活,进而抑制细胞线粒体凋亡途径,最终对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤起保护作用。本课题从细胞水平研究了SJP对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用,并深入探讨了SJP的作用机制,为PD的治疗提供了新的方法和依据,也为刺参以及海洋糖类药物的进一步开发利用提供了实验依据。