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肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一。我国是肝癌高发国家,其发病率和死亡率较高。由于早期无明显症状,大多患者发现时已处于中晚期,预后较差。因此,疾病的早期诊断对于患者的治疗及预后尤为重要。目前,肝癌常用的血清诊断标志物主要有甲胎蛋白(AFP)、凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)以及分泌型蛋白Dickkopf-1(DKK1)等,这些指标均与肝癌的发生与发展有着密切的关联,但在早期肝癌检测中效能较低,因此临床上急需新型血清标志物应用至肝癌的早期诊断,以期提高生存率。近年来,研究发现细胞骨架蛋白4(CKAP4)在肝癌组织中高表达,且在早期肝癌的诊断中具有较高的敏感性和特异性,有望成为肝癌高危人群及早期患者辅助诊断的重要指标。当前,临床上缺乏CKAP4标志物的床旁快速检测方法,因此,本研究拟采用荧光免疫层析技术,建立一种血清CKAP4荧光免疫层析定量快速检测方法,为肝癌高危人群及早期患者辅助诊断提供一种操作简便、价格低廉的床旁快速检测方法。本研究将构建的含CKAP4基因重组质粒的菌株进行诱导表达,分别对诱导温度、表达时间和诱导剂浓度进行优化,通过SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白表达情况,采用亲和层析法纯化目的蛋白,获得CKAP4抗原。根据参考品制备标准,反复标定CKAP4抗原制备室内参考品,梯度稀释制备CKAP4荧光免疫层析精密性、线性参考品,同时对参考品稳定性进行探究。在CKAP4蛋白时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立中:我们分别从玻璃纤维棉、硝酸纤维素膜、抗体等方面进行原材料探究;从标记抗体量、包被抗体的浓度、活化剂用量、缓冲液p H、保护液组方等方面进行工艺和组方研究。采用优化后工艺制备试纸条,分别从线性、精密度、灵敏度、准确度、特异性、稳定性等方面对试纸条进行性能评价。本研究确定了BL21(DE3)/p ET32a-CKAP4重组菌最佳诱导条件:诱导温度为37℃,诱导时间为4 h,IPTG浓度为1.0 mmol/L。通过SDS-PAGE电泳检测,目的蛋白以包涵体的形式表达,且分子量与预期一致,通过Western Blot进行鉴定,目的蛋白抗原性良好;通过梯度透析目的蛋白可有效复性。采用复性的目的蛋白,分别制备一份CKAP4蛋白含量为20μg/m L、50μg/m L的室内参考品,所制备的参考品可在4℃稳定保存1周,﹣80℃稳定保存12个月。初步建立了CKAP4荧光免疫层析快速检测方法。CKAP4的线性检测范围为:25-1000pg/m L,最低检出限为15 pg/m L;批内及批间变异系数均在15%以内,符合精密度要求;回收率在85%-115%之间,与肝癌标志物AFP、PIVKA-Ⅱ无交叉反应。在37℃条件下可保存20天,稳定性良好;通过检测87份样本,结果表明与ELISA相关性良好。本研究以CKAP4作为研究标志物,成功在原核表达系统中表达了CKAP4,获得了具有免疫学活性的CKAP4重组蛋白抗原,可用作免疫原及参考品制备;制备了一套可用于CKAP4荧光免疫层析试纸条检测的线性、精密性参考品。初步建立了CKAP4荧光免疫层析快速检测方法,为肝癌高危人群及早期患者辅助诊断提供一种快速、灵敏、简便、经济、可单人份操作的检测手段。