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随着现代畜牧业的发展,高效精确的性别控制技术已经成为提高家畜生产经济效益的重要技术手段。性控精液是实现性别控制最重要的方法,不仅能够给养殖业带来巨大的经济效益,还可加快育种进程,并充分发挥优良公畜的遗传潜力。基于X和Y精子之间的差异,目前研究报道了许多用于分离X和Y精子的方法,例如流式细胞仪分选法、Percoll和白蛋白梯度离心法、上游法和免疫学方法等。但是,目前只有流式细胞仪分选X、Y精子被证明是最稳定、有效的方法,该技术基于X、Y精子之间DNA含量的差异而实现两种精子的分离,并已在奶牛业实现商业化应用。然而,利用流式细胞仪分选X、Y精子依然存在经济成本高、分离过程中精子易受损伤等问题,极大限制了其在畜牧业中的广泛应用。近年来,我国牛肉需求量快速增长,但产量明显不足,且能繁母牛数量较少,这严重制约了我国肉牛产业的健康发展。因此,肉牛业需要一种经济、高效且危害性较小的精子分选方法,以期快速扩繁良种母牛,促进肉牛产业的发展。免疫学方法是根据X、Y精子的蛋白差异而将其分离,已逐渐成为替代流式细胞仪的一种有吸引力的方法。因此,本试验通过对秦川牛睾丸圆形精子、附睾精子、成熟精子的TLR7/8免疫荧光染色,确定TLR7/8在X精子中的特异性,同时研究TLR7/8激动剂R848对精子运动性能的影响,并评估分选后X、Y精子纯度,初步建立肉牛精子TLR7/8特异蛋白激活分选技术。本研究主要获得如下结果:1.对秦川牛睾丸组织、附睾组织和成熟精子进行TLR7和TLR8免疫荧光染色,利用PNA标记精子。结果显示,TLR7/8在睾丸圆形精子和附睾精子中均部分表达,其中TLR7阳性（TLR7+）精子和TLR8阳性（TLR8+）精子分别占睾丸圆形精子的47.61%±2.21%和47.57%±0.63%,而TLR7+精子和TLR8+精子分别占附睾精子的45.87%±2.61%和44.81%±2.26%。TLR7和TLR8分别定位于成熟精子尾部鞭毛和尾部中段,且TLR7+精子和TLR8+精子分别占总精子的55.54%±1.65%和54.12%±4.20%。2.为探究TLR7/8激动剂R848对精子运动性能的影响,将不同浓度（0、0.06、0.6、1、2、4μmol/L）TLR7/8激动剂R848与精子共孵育,分析上浮精子的比例。结果显示,R848浓度为0.6、1、2和4μmol/L处理组时上层X精子比例显著低于对照组（P＜0.05）。同时,将0.6μmol/L的R848分别与精子孵育0、15、30、60和120 min,发现15 min后,上层X精子的比例与对照组相比开始显著下降（P＜0.05）,上层X精子的数量呈现出时间依赖性下降,即随着时间的增加,上层X精子的数量逐渐下降,且R848与精子孵育60 min后,上层精子数量和对照组相比大约降低了50%。此外,下层X精子（取下层精液1 m L）VAP、VSL和VCL均显著低于上层Y精子（取上层精液1 m L）和对照组（P＜0.05）,且下层X精子运动轨迹变短;同时下层X精子活力较上层Y精子和对照组显著下降（P＜0.05）,而上、下层精子的质膜完整率和顶体完整率与对照组相比无显著变化（P＞0.05）,表明TLR7/8激动剂R848抑制了下层X精子的运动性能,但对上、下层的精子质量无明显影响。3.为探究TLR7/8激动剂R848影响精子运动性能的原因,将0.6μmol/L的R848与精子共孵育1 h,检测上、下层精子的ATP和线粒体膜电位。结果显示,下层X精子的ATP和线粒体膜电位均显著低于上层Y精子和对照组（P＜0.05）。同时,将精子与R848分别孵育0、15、30、45和60 min,发现R848与精子孵育30、45、60 min时,其ATP和线粒体膜电位较对照组显著下降（P＜0.05）。为揭示R848降低精子ATP和线粒体膜电位的机理,将R848与精子孵育1 h后,对上层Y精子和下层X精子进行Western blot检测,发现下层X精子NFκB和GSK3α/β的磷酸化水平相较于上层Y精子显著增加（P＜0.05）。此外,R848与精子孵育15 min和30 min后,NFκB和GSK3α/β的磷酸化水平和对照组相比显著增加（P＜0.05）。对分选后的X、Y精子进行TLR7免疫荧光染色,发现X精子大多数为TLR7+精子,而Y精子只有少数为TLR7+精子。使用流式细胞仪对其进行纯度重分析,发现Y精子纯度为88.6%,而X精子纯度为72.5%。综上所述,本研究发现TLR7和TLR8在睾丸圆形精子、附睾精子、成熟精子中均为部分表达,且TLR7/8激动剂R848通过GSK3α/β、NFκB磷酸化途径抑制糖酵解产生ATP和降低精子线粒体膜电位,从而降低精子活力,并抑制精子的运动,但其对精子质量的影响较小。此外,分选后Y精子和X精子纯度分别达到88.6%和72.5%。因此,本研究初步建立了肉牛精子特异蛋白激活分选技术,可为研发牛性控精液新技术提供理论参考。