【摘 要】
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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种具有急性、破坏性、传染性极高等特征的肠道疾病,严重的水样腹泻、呕吐、脱水、少食或不食和哺乳仔猪的高死亡率是其引起的主要临床症状。全世界养猪业因此遭受重大冲击。PEDV的纤突蛋白（S）是一种Ι型包膜糖蛋白并具有跨膜结构,由
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2017YFD0500605）；
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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种具有急性、破坏性、传染性极高等特征的肠道疾病,严重的水样腹泻、呕吐、脱水、少食或不食和哺乳仔猪的高死亡率是其引起的主要临床症状。全世界养猪业因此遭受重大冲击。PEDV的纤突蛋白（S）是一种Ι型包膜糖蛋白并具有跨膜结构,由S1和S2结构域组成,分别负责病毒结合和融合。在与细胞受体特异性、高亲和力结合以及诱导猪机体产生中和抗体的过程中S1结构域发挥了至关重要的作用,是研发预防PEDV疫苗和用于诊断分析的候选靶标。该研究中,利用SX-NQ PEDV变异毒株的cDNA为模板经PCR扩增获得截短的PEDV S1基因片段,将其克隆到原核表达载体p ET-32a后转入E.coli BL21（DE3）表达感受态细胞中进行诱导表达,并利用SDS-PAGE和western blot进行鉴定。确定最佳诱导表达条件为:25℃,IPTG浓度为1mm/L诱导培养4h,目的蛋白以包涵体的形式存在。利用Ni-NTA对其进行纯化,通过梯度透析的方法使其复性,以获得高纯度和有生物活性的蛋白。利用获得的蛋白免疫小鼠进行多克隆抗体制备,三次免疫后小鼠血清中S1蛋白抗体效价达到1:200000,运用IFA、western blot实验进行鉴定,结果均显示制备的截短S1蛋白多克隆抗体可以与杆状病毒表达的PEDV S蛋白产生特异性结合。以纯化复性的S1蛋白作为检测抗原,进行PEDV抗体间接ELISA检测方法的建立,通过实验确定了ELISA的最优试验条件为:用最佳抗原包被浓度4μg/m L,4℃包被过夜,25℃封闭90分钟,被检血清1:100稀释后25℃孵育90分钟,酶标二抗按1:2500稀释作用90分钟后显色,读取OD450值。并确定了该方法的临界值为0.177。经鉴定该方法具有特异性强、稳定性好、与商业化试剂盒比较具有一定符合率等特点。运用该方法对384份猪血清抗体进行测定,样品阳性率为83.3%。初步证明了该方法的适用性。综上所述,本实验通过原核表达获得纯度较高的PEDV截短S1蛋白,免疫小鼠制备了多克隆抗体,并建立了间接ELISA检测方法。为研发PEDV的临床诊断试剂盒提供了前期基础。
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