目的：1．克隆血管内皮细胞生长因子受体-2（VEGFR-2／KDR）胞外段三区基因。2．制备具有良好抗原性的人KDR3重组蛋白。3．制备具有生物学活性的VEGF₁₆₅重组蛋白。4．制备抗人KDR3单克隆抗体，研究所获得抗体的相关生物学活性。为进一步研究血管内皮细胞生长因子受体-2抗体在肿瘤诊断和治疗中的作用奠定基础。方法：1．从ECV304细胞株中提取总RNA，逆转录获得cDNA，用设计合成的人VEGFR-2／KDR胞外段三区基因的引物，以PCR的方法扩增人VEGFR-2／KDR胞外三区基因，连接到T载体测序。2．将人VEGFR-2／KDR胞外三区基因克隆至原核表达载体pET28a（+）中，将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α内并提取质粒，双酶切鉴定，将鉴定的阳性表达载体质粒pET28a（+）-KDR3转化至大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物用Ni²⁺-NTA纯化，收集洗脱液。3．同KDR3制备方法制备VEGF₁₆₅。将制备的VEGF165按一定的浓度梯度入加到接种有HUVEC细胞的96孔细胞培养板中，培养24h，加入MTT，酶标仪测定细胞培养物A_570nm值。4．用重组人KDR3蛋白免疫BALB／c小鼠，取脾B淋巴细胞与SP2／0细胞融合，有限稀释法筛选、制备单克隆细胞株。将单克隆细胞株接种到降植烷致敏的F1代小鼠腹腔，2周后收集腹水，腹水用Protein ASepharose CL-4B柱纯化。Western Blot鉴定其抗原的结合特性，在VEGF₁₆₅刺激HUVEC细胞增殖实验中加入纯化的抗人KDR3单抗，培养24h，加入MTT，酶标仪测定细胞培养物A_570nm值。结果：1．扩增获得的人VEGFR-2／KDR胞外三区基因测序结果与genebank中的KDR序列一致。2．构建的pET28a（+）-KDR3重组质粒双酶切后，琼脂糖凝胶电泳见300 bp左右大小的DNA条带。pET28a（+）-KDR3／BL21（DE3）诱导后有相对分子质量为16 000的蛋白表达。3．构建的pET28a（+）-VEGF₁₆₅重组质粒双酶切后，琼脂糖凝胶电泳见约580 bp大小的DNA条带。pET28a（+）-VEGF₁₆₅／BL21（DE3）诱导后有相对分子质量为26 000的蛋白表达。在0.02μg／ml到0.5μg／ml浓度范围内随着VEGF₁₆₅浓度的增高，MTT吸光度值相应增高。4．纯化获得了4株抗人VEGFR-2／KDR胞外段三区的单克隆抗体。Western Blot结果显示单克隆抗体2C2能与人KDR3特异性结合。加有单克隆抗体2C2组的MTT吸光度值与未加2C2组比较有显著性差异。结论：1．成功地克隆了人VEGFR-2／KDR胞外三区基因。2．获得了具有良好抗原性的人VEGFR-2／KDR胞外段三区重组蛋白。3．获得了VEGF₁₆₅重组蛋白，该蛋白具有刺激血管内皮细胞增殖的生物学活性。4．获得4株能分泌抗人KDR3单抗的杂交瘤细胞株。2C2单抗能抑制VEGF₁₆₅刺激血管内皮细胞的增殖。为进一步研究抗人KDR3抗体在抗血管新生及肿瘤诊断、治疗中的作用奠定基础。