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背景缺血性脑卒中（Ischemic stroke,IS）是一类高发病率、高致死致残率、严重危害人类生命健康的脑血管疾病。IS主要是由脑供血动脉闭塞导致脑组织供血不足引起,目前临床常用的治疗方法有静脉溶栓及手术取栓等,不同治疗方法的共同目标是尽早使闭塞血管再通,恢复缺血脑组织的血液供应,挽救濒临死亡的神经细胞。但血液的再灌注有时候可能会加重缺血脑组织的损伤,引发更严重的神经功能缺损,这种病理生理现象称为脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）,引起CIRI的确切机制尚不十分清楚。程序性坏死是独立于坏死和凋亡之外的一种细胞死亡方式,主要由受体相互作用蛋白激酶 1（Receptor interacting protein kinase 1,RIPK1）、受体相互作用蛋白激酶3（Receptor interacting protein kinase 3,RIPK3）和混合谱系假激酶结构域样蛋白（Mixedlineagekinasedomain-likeprotein,MLKL）介导。多项研究表明,程序性坏死参与了 CIRI的病理生理过程。动物实验显示抑制程序性坏死可改善小鼠CIRI的神经功能缺损症状。研究表明,卒中后的炎症反应可加重CIRI。缺血性脑卒中发生后,多种细胞,如小胶质细胞和星形胶质细胞被激活。这些激活的细胞释放多种炎症介质。此外,程序性坏死被认为是一种促炎的细胞死亡方式,受损细胞释放的损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns,DAMPs）等内源性分子可触发机体炎症反应,加重脑组织损害。抑制炎症可以减轻脑缺血再灌注（Cerebral ischemia-reperfusion,CIR）后的脑损伤。热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白（Carboxyl terminus of the Hsp70 interacting protein,CHIP）是一种由STUB1基因编码,分子量约35kDa的蛋白质。CHIP在多个组织特别是代谢活跃的组织如脑、心脏、骨骼肌、睾丸等大量表达。CHIP蛋白具有E3泛素化酶活性,能够泛素化降解多种底物蛋白。同时CHIP蛋白可以与部分热休克蛋白相互作用,参与蛋白质质量控制系统。研究表明,程序性坏死核心调控蛋白RIPK3也是E3连接酶CHIP的一种底物,CHIP能够泛素化RIPK3,并调控其通过泛素-蛋白酶体通路降解,进而减弱程序性坏死水平。同时,研究还表明,CHIP蛋白也可参与免疫调节反应,如CHIP蛋白过表达可减轻心肌功能障碍小鼠模型中的心肌炎症反应。CHIP蛋白是否可通过调节程序性坏死和炎症从而影响CIRI尚不十分清楚。本研究通过使用中枢神经系统CHIP蛋白过表达小鼠（为书写方便,命名为KI小鼠）与野生型（Wildtype,WT）配对小鼠构建CIRI模型,研究CHIP蛋白在小鼠CIRI模型中的作用及机制,为IS的治疗提供新的靶点和思路。目的1.构建KI小鼠,比较KI小鼠与WT小鼠的CHIP蛋白表达水平;2.观察WT小鼠CIR后不同时间点CHIP蛋白的表达情况,筛选出小鼠CIR后CHIP蛋白表达量变化最大的时间点进行后续实验;3.使用KI小鼠与WT小鼠构建CIRI模型,研究不同CHIP蛋白表达水平对小鼠CIRI后脑梗死体积、行为学、脑水肿、组织病理学的影响,以评估CHIP蛋白对CIRI的潜在神经保护作用。4.检测小鼠CIRI后程序性坏死相关蛋白和细胞因子表达水平的变化,探讨CHIP蛋白过表达对CIRI后的程序性坏死和炎症的调控作用。方法1.采用Western blot、RT-PCR和免疫荧光检测CHIP蛋白在KI小鼠脑组织和WT小鼠脑组织的表达水平,比较CHIP蛋白在两种小鼠脑组织表达水平的差异;2.构建小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型用于模拟CIR过程。随机将WT小鼠分为正常组（Normal）、假手术组（Sham）、MCAO/R6h 组、12h 组、24h 组、48h 组、72h组,每组6只小鼠,采用WB、RT-PCR、免疫荧光检测各组小鼠脑组织缺血半暗带CHIP蛋白表达水平,寻找出CIR后CHIP蛋白表达变化最大的时间点进行后续实验;3.将小鼠分为四组:WT小鼠假手术组（WT-Sham）、KI小鼠假手术组（KI-Sham）、WT 小鼠 CIRI 组（WT-MCAO）、KI 小鼠 CIRI 组（KI-MCAO）,根据分组对WT小鼠和KI小鼠进行假手术或者MCAO手术;4.四组小鼠接受假手术或MCAO手术后,在规定的时间点采用Zea-longa评分法评估小鼠术后神经功能缺损、TTC染色检测梗死体积大小、干湿重法分析小鼠脑水肿程度、HE和Nissl染色检测小鼠皮层组织细胞病理形态学改变、TUNEL染色检测小鼠大脑皮层和海马CA1区细胞凋亡情况;5.Western blot 检测程序性坏死相关蛋白 RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL、MLKL蛋白表达水平;6.ELISA检测小鼠缺血半暗带组织和血液组织中的细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素 1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素 6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素 10（Interleukin-10,IL-10）的表达水平。结果1.CHIP蛋白在KI小鼠脑组织中过表达,与WT小鼠相比,KI小鼠大脑皮层、纹状体、海马组织中的CHIP蛋白表达增加;2.Western-blot和RT-PCR结果显示,WT小鼠MCAO造模后CHIP蛋白在缺血半暗带脑组织表达升高,表现为CHIP蛋白表达在再灌注后6h增加且在6h-24h呈上升趋势,24h时达到最大值,在24h-72h呈下降趋势,但仍高于Sham组;3.MCAO手术后,Zea-longa评分法结果显示CHIP蛋白过表达减轻小鼠神经功能缺损,TTC染色结果表明CHIP蛋白过表达减少小鼠梗死体积,干湿重法结果表明CHIP蛋白过表达减轻小鼠脑水肿程度,HE和Nissl染色结果提示CHIP蛋白过表达减轻小鼠脑组织梗死周围的细胞损伤,TUNEL染色结果表明CHIP蛋白过表达减少小鼠大脑皮层和海马CA1区细胞凋亡水平;4.Western blot结果显示,小鼠MCAO手术后缺血半暗带脑组织程序性坏死水平升高。CHIP蛋白过表达减轻小鼠MCAO手术后缺血半暗带程序性坏死水平,程序性坏死相关蛋白RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL、MLKL表达水平降低;5.ELISA结果显示CHIP蛋白过表达减轻小鼠MCAO手术后的炎症反应,与WT小鼠相比,KI小鼠缺血半暗带和血浆中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平降低,抗炎细胞因子IL-10的表达水平升高。结论1.CHIP蛋白过表达可以减轻CIRI,表现为减少脑梗死体积、减轻神经功能缺损、脑水肿、神经细胞损伤;2.程序性坏死和炎症反应参与了 CIRI。CHIP蛋白过表达对CIRI的神经保护作用可能是通过对程序性坏死和炎症反应的调控作用实现的。