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目前应用于临床的抗体,都局限于靶向细胞表面或细胞外的抗原,究其原因,主要是靶向细胞内抗原的抗体难以直接穿越细胞膜。据统计,细胞内蛋白分子几乎占了人类基因组编码的蛋白质的一半,这些分子可能是潜在的抗体治疗靶点。因此,解决抗体跨细胞膜的递送难题,无论是对基础细胞生物学研究还是针对临床应用,都具有重要意义。针对上述抗体向细胞内递送的难题,众多科学家进行了多方面的尝试,其中抗体小型化是思路之一。软骨鱼和骆驼科动物体内天然存在的稳定重链可变区（VHH）的单域抗体（sd Ab）也称纳米抗体（nanobody,Nb）,是已知最小的能够稳定表达的抗原结合蛋白。我们利用纳米抗体分子量小、结构稳定、特异性强的优点,探索抗体递送的方法。另一方面,尽管纳米抗体分子量相对较小,依然无法直接进入活细胞。考虑到核酸可以瞬时转染进入活细胞的事实,我们选用体外转录手段制备的mRNA（IVT mRNA）作为递送抗体的“介质”。基于上述考虑,我们针对靶分子制备纳米抗体,根据纳米抗体的氨基酸序列合成合适的基因序列,在体外转录成mRNA,然后将该mRNA转染入细胞使其在细胞内翻译成纳米抗体。该方法,我们称之为通过mRNA递送纳米抗体入细胞法（nanobodies into living cells via IVT mRNA,NiCeR）,简称NiCeR。1.纳米抗体进入活细胞（NiCeR）的方法学研究1)NiCeR技术的建立我们选择F-actin-GFP和Golgi-GFP为细胞内靶分子,根据抗GFP纳米抗体序列在体外制备mRNA,应用脂质体（liposome）将该mRNA转染进入培养的He La等细胞系中,使其在细胞内翻译抗GFP纳米抗体。此后,我们进一步选择内源性细胞质蛋白Vimentin为细胞内靶分子,利用NiCeR技术递送纳米抗体对Vimentin进行识别。结果显示,NiCeR技术递送的针对GFP的纳米抗体可以识别F-actin-GFP和Golgi-GFP;NiCeR技术递送的针对Vimentin的纳米抗体可以识别细胞质蛋白Vimentin。NiCeR技术递送的抗GFP纳米抗体可以在转染后3小时被检测到,并在转染后48小时开始降解;与此相对照,转染含有抗GFP纳米抗体序列的质粒DNA,转染后24小时才能检测到抗GFP纳米抗体,直到转染后72小时抗GFP纳米抗体的信号仍持续存在。由此可见,NiCeR技术用于递送纳米抗体进入细胞是有效的,并显示出特有的动态特征。2)NiCeR技术中mRNA组成元件的研究成熟的mRNA由5个主要调控元件组成。为了获得重要组件对纳米抗体表达的影响,我们对mRNA进行不同的设计,包括修饰后的mRNA;未修饰的mRNA;修饰后的无UTR结构的mRNA;修饰后的Poly（A）尾长150nt的mRNA;修饰后的无m7G帽子的mRNA。结果显示,无m7G帽子结构的mRNA转染后检测不到抗GFP纳米抗体;Poly（A）尾长150nt和无UTR结构的mRNA,转染后,抗GFP纳米抗体的表达水平下降。由此可见,m7G帽子结构对mRNA翻译蛋白至关重要;而Poly（A）尾长的减少和UTR结构对mRNA翻译蛋白有一定的影响。2.抗HDAC6纳米抗体靶向胞质内源性HDAC6的实验研究1)抗HDAC6纳米抗体的制备与鉴定以HDAC6-CAT1为抗原,免疫骆驼,通过噬菌体展示技术,淘选出针对HDAC6-CAT1的纳米抗体。经体外原核表达和纯化,筛选出14株可溶性表达的纳米抗体,其中9株纳米抗体体外高度结合HDAC6-WT。经MG132诱导后,大肠杆菌表达的纳米抗体蛋白,可以识别体内的HDAC6形成的细胞内聚合体。进一步分析显示,与抗HDAC6单克隆抗体相比,NiCeR技术递送的53号纳米抗体可以更加清晰地观察到HDAC6形成的聚合体。2)应用NiCeR技术递送特异性纳米抗体靶向内源性胞质HDAC6应用NiCeR技术分别递送9株抗HDAC6纳米抗体,在细胞质中检测到纳米抗体的存在。在147和156号抗HDAC6纳米抗体的作用下,与TSA作用相比,检测出cortactin乙酰化水平更明显上升,表明这两株纳米抗体更加抑制HDAC6的活性。在53,147和156号抗HDAC6纳米抗体的作用下,与未转染纳米抗体的对照细胞相比,鉴定出Phalloidin特异标记的F-actin多聚体的相对荧光减少,F-actin多聚化水平抑制,F-actin解聚,可能进一步影响细胞迁移和增殖。利用体外截短表达HDAC6-CAT1,分别与9株纳米抗体结合,分析出53,147和156号抗HDAC6纳米抗体分别识别不同的HDAC6-CAT1抗原表位。研究显示,NiCeR技术能高效递送特异性纳米抗体进入活细胞,靶向内源性胞质靶分子HDAC6。该研究为抗体靶向细胞内抗原提供了新的思路,也可能为HDAC6选择性抑制剂的研发提供有效的技术支持。本论文建立了NiCeR技术,用于递送纳米抗体进入细胞质。根据纳米抗体的DNA序列,在体外转录成mRNA,然后将该mRNA转染进入细胞,mRNA在细胞内翻译成纳米抗体。本文探讨了修饰后的核苷酸,m7G帽子结构,Poly（A）尾长和UTR结构对mRNA转染后,在细胞内翻译纳米抗体的影响。本文筛选了针对HDAC6的纳米抗体,根据建立的NiCeR技术递送抗HDAC6纳米抗体进入细胞,为针对HDAC6的纳米抗体的潜在药物研发,提供了理论依据。