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目的:研究Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的作用,探讨骨关节炎发病的途径和分子机制;观察补肾活血方对异常的滑膜-软骨微环境的调控作用,初步阐释补肾活血方治疗骨关节炎的分子作用机制。 方法:本研究通过构建β-catenin过表达慢病毒载体转染正常人滑膜细胞。Transwell小室共培养Wnt/β-catenin信号通路激活的人滑膜细胞与正常人软骨细胞以模拟滑膜软骨关节体系内环境,倒置显微镜观察滑膜细胞对软骨细胞的生长形态变化的影响;采用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测不同时间点滑膜-软骨共培养体系中软骨细胞培养上清液中MMP-7的变化,了解Wnt/β-catenin信号通路活化的滑膜细胞对软骨细胞的影响,找出滑膜细胞与软骨细胞共培养体系中软骨细胞上清液中MMP7变化最明显的时间点。补肾活血方含药血清干预共培养体系,采用Westernbolt方法检测补肾活血方对滑膜细胞β-catenin蛋白表达的影响;采用ELISA方法检测补肾活血方对共培养体系中滑膜细胞、软骨细胞培养上清液MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表达的影响。 结果:成功构建β-catenin过表达慢病毒,过表达慢病毒转染正常人滑膜细胞后滑膜细胞胞浆和胞核内β-catenin蛋白表达明显升高,并可持续表达。Wnt信号通路激活的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后,不同时间点光镜下观察发现软骨细胞生长形态变化不明显,但随共培养时间的延长软骨细胞生长受到抑制,胞体边缘发白,贴壁强度降低。ELISA结果显示Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后软骨细胞上清液中MMP-7表达明显升高,与正常滑膜细胞与软骨共培养相比MMP-7表达有显著差异。通路激活的滑膜细胞对软骨细胞培养上清液MMP-7的影响有时间依赖性,在共培养2h、6h、12h时逐渐升高,24h时略有降低,而在共培养6h时软骨细胞培养上清液中MMP-7变化最为明显。补肾活血方干预后,Western blot检测发现补肾活血方能够明显下调共培养滑膜细胞中β-catenin蛋白的表达;同时,ELISA法检测发现通路激活的滑膜细胞与软骨细胞共培养后,滑膜细胞与软骨细胞培养上清液中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表达与正常对照相比明显升高,补肾活血方能够明显下调滑膜细胞与软骨细胞培养上清液中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表达。 结论: 1.β-catenin过表达慢病毒转染滑膜细胞后,可促使滑膜细胞持续过表达β-catenin,导致胞浆中β-catenin累积转入胞核,从而激活Wnt/β-catenin信号通路。2.滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活可以使共培养体系中MMP-7表达明显升高,验证了MMP-7是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因。3.Wnt/β-catenin信号通路激活的滑膜细胞与软骨细胞共培养,随共培养时间的延长,软骨细胞生长受到抑制,胞体边缘发白,贴壁强度降低,说明异常的滑膜细胞影响正常软骨细胞的生长。4.Wnt/β-catenin信号通路激活后共培养体系中CTX-Ⅱ、COMP明显上升,说明Wnt/β-catenin信号通路激活的滑膜细胞可以促使软骨基质的降解,这可能是滑膜炎促进骨关节炎发生、发展的机制之一。 5.补肾活血方可以抑制滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路,下调共培养体系中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表达,减轻了异常滑膜细胞对软骨细胞的损害,减缓了软骨基质的降解,有利于软骨细胞正常功能的恢复。6.补肾活血方对膝骨关节炎的治疗作用可能是通过抑制OA滑膜Wnt/β-catenin信号通路,改善滑膜炎症,调控滑膜-软骨共同体系微环境,达到抑制软骨降解,促进软骨细胞功能恢复而实现的。