背景：目前恶性肿瘤威胁着人类的健康及生命,且有向年轻化转变的趋势,使人们谈癌色变。在消化道恶性肿瘤中以结直肠癌发病率最高,特别在欧美等发达国家和地区,居民结直肠癌发病率和死因排名均位居恶性肿瘤前列。在我国,随着生活水平的提高,结直肠癌正以年3%-4%的速度增长。近30年来,对于结直肠癌治疗效果进步并不大,主要以手术为主,以化疗和放疗为辅,5年生存率围绕在50%-60%之间。自Vogelstein提出经典的结直肠癌多基因、多步骤的发生发展模式以来,许多与结直肠癌发生发展相关的基因不断被揭示。因此,揭示隐蔽在结直肠癌发生发展过程中的内在分子病理改变,将对结直肠癌发病机制的深入了解以及该病的防治具有十分重要的理论价值和现实意义。研究发现,结直肠癌是肠上皮细胞受遗传和环境等综合作用导致基因突变的结果,其中涉及多基因改变的累积过程,如癌基因的激活,抑癌基因和错配修复基因的突变、失活,特别是抑癌基因的失活在其中发挥重要作用,所以只有从基因方面来探索才能从根本上治愈癌症。随着生命科学的快速发展和肿瘤分子生物学知识的积累,兴起了针对结直肠癌生物学行为各方面生物治疗的研究。通过分子生物学检测手段可早期发现肿瘤并达到分子诊断,对有关突变基因的检测可为判断预后,提供恰当的临床治疗依据。阐明结直肠癌发生发展相关的分子机制,寻找合适的靶分子仍在进一步努力当中。近年来研究发现,癌基因和抑癌基因的表达失调与结直肠癌密切相关。Runx3(runt-related transcription factor3)是Runx家族成员之一,人类Runx家族是由Runx1、Runx2、Runx3三个成员组成,他们都是重要的转录因子。人类Runx3基因位于染色体1p36.1,基因全长为67kb,含有P1、P2两个启动子、6个外显子和1290bp的开放阅读框。Runx3mRNA主要来自P2启动子转录的产物,因P2启动子中鸟嘌呤(guanine, G)和胞嘧啶(cytosine, C)含量较高(64%),故在理论上其要比P1启动子易发生甲基化。目前已证实Runx3为抑癌基因,其蛋白广泛表达于人体内。Runx3的抑癌机制与具有生长抑制和凋亡诱导因子功能的TGF-β通路密切相关。TGF-β是多种细胞的生长抑制因子,激活后与具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的TGF-β受体Ⅰ和Ⅱ相结合,产生异四聚体复合物(T βRC),触发细胞内信号通路。研究表明,Runx3蛋白需要在TGF-β的协助下才能由细胞质进入细胞核,使Runx3蛋白在靶基因启动子区可与众多转录因子相互作用,从而增强或主动抑制靶基因的转录激活。Runx3抑癌基因是转化生长因子(TGF-β)转导通路中的关键因子,参与TGF-β通路对上皮细胞的负性调控,与细胞分化、细胞周期调控、细胞凋亡和恶性转化有关,主要机制是启动子区甲基化以及杂合性缺失,已证实其表达失活可能导致多种恶性肿瘤的发生,其中包括黑色素瘤、胃癌、结直肠癌、肺癌、胆管癌、肝癌、淋巴瘤等。原癌基因myc(v-myc)最初发现于鸡的逆转录病毒中,其在哺乳动物中的同源对应物为C-myc基因。人原癌基因C-myc结构独特,由3个外显子和2个内含子组成,第1外显子无编码序列,只起调节作用,外显子2和3编码包含493个氨基酸残基蛋白质。正负调控子位于C-myc的5’端第1外显子和第1内含子内。在第1外显子5’端序列中,有两个促进子P1和P2,它们分别转录2.4Kb和2.2Kb两种mRNA,来合成半衰期短的两种蛋白P67和P64。C-myc蛋白可与Max蛋白形成稳定的二聚体,特异地识别DNA序列中的CACGTG核心序列并通过碱性区与之结合,使靶基因转录增强。C-myc具有双向调节功能,既可介导细胞增殖,又可介导细胞凋亡,其调节方向取决于细胞接受的信号及细胞所处的生长环境。C-myc基因与细胞生长分裂密切相关,能够调控细胞增殖或分化,其过度表达可诱导细胞转化与肿瘤形成。低甲基化可引起C-myc基因活化,导致核型不稳定,促进肿瘤的发生。既往研究发现C-myc的过表达参与多种肿瘤的发生、发展,如宫颈癌、淋巴瘤、鼻咽癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等,还报道了C-myc可促进血管内皮生长因子的表达,促进新生血管形成,为肿瘤形成提供条件。随着研究的深入,表观遗传学修饰包括癌基因及抑癌基因启动子DNA不同程度的甲基化和组蛋白乙酰化,导致的基因转录失活引发肿瘤,引起了越来越多的重视。目前,结合调控基因表达的两大机制(DNA甲基化和组蛋白去乙酰化),提出一种治疗恶性肿瘤的新思路—“转录治疗”,即通过改变DNA甲基化和组蛋白去乙酰化来诱导基因的重新表达。结直肠癌是一个多基因参与,多阶段演变的复杂过程,同样伴随着多种分子事件的发生。主要涉及到癌基因激活和抑癌基因失活,引起细胞内多基因变化,从而导致细胞生长,凋亡等异常,引发肿瘤。临床对于恶性肿瘤的治疗很困难,探索抑癌基因重新表达,癌基因低表达,可能有助于延缓肿瘤的进展。联合运用药物抑制癌基因表达及促进抑癌基因表达,对基因表达进行干预,可能对大肠癌的发生发展起新作用,药物联用可能有良好的临床应用前景。目的：本研究旨在探讨Runx3和C-myc基因在结直肠癌组织中的表达情况,探索Runx3、C-myc与结直肠癌病员临床病理分期间的关系,为下一步利用基因治疗结直肠癌提供新的作用靶标。方法：采用实时荧光定量PCR技术检测38例结直肠癌病人的癌组织及相应癌旁正常组织(距癌缘>5cm)中Runx3mRNA和C-myc mRNA的表达水平；Western-blot免疫印迹法检测63例结直肠癌病人的癌组织及相应癌旁正常组织中Runx3蛋白和C-myc蛋白的表达水平。统计分析：计量资料数据以均数±标准差(X±S)表示。运用SPSS13.0软件,对所得一般性数据做正态分布检验和组间方差齐性检验；两项符合,采用参数统计的单因素方差分析(One-WayANOVA)进行统计处理,二指标相关性应用线性相关分析。P<0.05被视为差异具有统计学意义。结果：1、Runx3在结直肠癌组织中的表达较之对照组癌旁正常组织下调。Runx3mRNA在Dukes A期与B期、C期+D期间表达差异均有统计学意义p<0.05),而B期与C期+D期间差异无显著性；Runx3蛋白在Dukes A期与B期、C期+D期间表达差异均有统计学意义(p<0.05),而B期与C期+D期间差异无显著性。Runx3mRNA在浸润深度T1+T2和T3+T4间差异有统计学意(p=0.000),而T1和T2、T3和T4之间表达差异则无统计学意义；Runx3蛋白在浸润深度T1、T2和T3、T4间差异有统计学意义(p=0.000),而T1和T2、T3和T4之间表达差异则无统计学意义。Runx3mRNA在病理分化类型高分化、中分化、低分化组间差异均有显著性(p=0.031)；Runx3蛋白表达在低分化组与高分化、中分化组间比较差异有显著性(p=0.001),高分化组与中分化组间差异均无显著性。Runx3mRNA的表达在淋巴结转移阴性和阳性组间差别有显著性(p=0.026)；Runx3蛋白在淋巴结转移阴性和阳性组间差别有显著性(p=0.001)。Runx3mRNA与患者性别、年龄、肿瘤病灶部位、组织类型差异无显著性,与肿瘤腔内直径差异有显著性(p=0.046); Runx3蛋白与患者性别、年龄、肿瘤病灶部位差异无显著性,与组织类型、肿瘤腔内直径差异均有显著性(p=0.034,p=0.042)。2. C-myc在结直肠癌组织中的表达较之对照组癌旁组织上调。C-myc mRNA在Dukes A期、B期与C期+D期间表达差异有统计学意义(p=0.000),而A期与B期间差异无显著性；C-myc蛋白在Dukes A期、B期和C期+D期间表达差异均有统计学意义(p=0.000),而Dukes A期与B期间表达差异性无显著性。C-myc mRNA在浸润深度T1+T2和T3+T4间差异有统计学意义(p=0.000),而T1和T2、T3和T4之间表达差异则无统计学意义；C-myc蛋白在浸润深度T1、T2和T3、T4间差异有统计学意义(p=0.006),而T1和T2、T3和T4之间表达差异则无统计学意义。C-myc mRNA在高分化组与中、低分化组间差异均有显著性(p=0.035),中分化组与低分化组间差异无显著性；C-myc蛋白在高分化,中分化,低分化组间两两比较差异有显著性(p=0.006)。C-myc mRNA的表达在淋巴结转移阴性和阳性组间差别有显著性(p=0.005)；C-myc蛋白表达在淋巴结转移阴性和阳性组间差别有显著性(p=0.012)。C-myc mRNA与患者性别、年龄、肿瘤病灶部位、组织类型,肿瘤腔内直径差异均无显著性；C-myc蛋白与患者性别、年龄、组织类型,肿瘤腔内直径差异无显著性,可能与肿瘤病灶部位差异有显著性(p=0.049)。3、Runx3蛋白与C-myc蛋白在结直癌中表达呈负相关(r=-0.398,p=0.001)。结论：1本文在mRNA水平与蛋白水平两个层面上,发现Runx3在结直肠癌组织中的表达较之对照组癌旁组织下调；C-myc在结直肠癌组织中的表达较之对照组癌旁组织上调,两者与肿瘤的Dukes分期、浸润深度、分化程度、淋巴结转移情况密切相关,从而阐述两者参与结直肠癌的发生、浸润、转移。2本文首次通过检测人结直肠癌手术标本中Runx3与C-myc表达,推测Runx3抑癌基因的表达失活,可能存在加强C-myc癌基因的表达,在蛋白表达水平发现二者存在负相关关系。3本文实验选材来源于临床病员,下一步可延伸随访病员生存率,评价此两基因表达失调对病员预后的影响,为寻找结直肠癌基因治疗靶点提供依据。