【摘 要】
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目的:糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy,DR）是糖尿病最常见的微血管并发症,也是发达国家工作人群中的首位致盲性眼病。长期高血糖导致的视网膜微血管损伤和神经退行性变引起人们对视网膜Müller细胞（retinal Müller cells,RMCs）的广泛关注。RMCs可以在高糖（high glucose,HG）环境下活化并发生胶质细胞增生,从而促进DR的发生发展。本研究探
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目的:糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy,DR）是糖尿病最常见的微血管并发症,也是发达国家工作人群中的首位致盲性眼病。长期高血糖导致的视网膜微血管损伤和神经退行性变引起人们对视网膜Müller细胞（retinal Müller cells,RMCs）的广泛关注。RMCs可以在高糖（high glucose,HG）环境下活化并发生胶质细胞增生,从而促进DR的发生发展。本研究探讨PPP1CA/YAP/GS/Gln/mTORC1信号通路在HG条件下对RMCs活化以及增殖情况的影响。方法:本研究利用HG刺激的人视网膜Müller细胞株（MIO-M1）建立2型糖尿病细胞模型,MIO-M1细胞经HG刺激后,转染PPP1CA siRNA,WB检测PPP1CA、p-YAP（S94和S127）和YAP的蛋白水平,细胞免疫荧光检测YAP的核转位,分析PPP1CA对HG条件下MIO-M1细胞中YAP去磷酸化及核转位的影响。CO-IP检测YAP与TEAD之间的相互作用,CHIP检测TEAD与GS启动子之间的结合;过表达YAP、YAP S94A、YAP S127A或者TEAD,并转染GS野生型或者突变型,荧光素酶报告实验检测YAP去磷酸化或者YAP与TEAD结合对GS启动子活性的影响;qRT-PCR和WB分别检测GS mRNA和蛋白水平的改变情况,分析TEAD和PPP1CA对YAP在HG条件下MIO-M1细胞中转录GS的影响。在HG条件下运用GS抑制剂D-2-AA,细胞免疫荧光检测GS的表达;GS酶活性实验检测GS的催化功能;ELISA检测MIO-M1细胞中谷氨酸和谷氨酰胺的蛋白水平,分析GS对HG条件下MIO-M1细胞中Gln生物合成的影响。在HG条件下运用D-2-AA或者谷氨酰胺酶激动剂ADP,谷氨酰胺酶活性实验检测谷氨酰胺酶的催化功能;WB检测磷酸化p-raptor/raptor、p-rictor/rictor、p-S6K1/S6K1、p-AKT/AKT 的蛋白水平,分析 Gln 对 HG条件下MIO-M1细胞中mTOR活化的影响。MIO-M1细胞进行PPP1CA敲低、YAP抑制剂维替泊芬、GS抑制剂D-2-AA、谷氨酰胺酶激动剂ADP和mTOR抑制剂雷帕霉素处理,以阻断PPP1CA/YAP/GS/Gln/mTORC1通路,EdU实验检测细胞增殖,WB检测GFAP和AQP4的表达,分析上述通路对HG条件下MIO-M1细胞增殖和活化的影响;构建腹腔注射链脲霉素（streptozotocin,STZ）和高脂饮食诱导的C57BL/6J小鼠2型糖尿病模型,阻断PPP1CA/YAP/GS/Gln/mTORC1通路,视网膜铺片后用GFAP和IB4双标分析阻断此通路对DR过程中RMCs增殖和活化的影响。结果:PPP1CA促进HG条件下MIO-M1细胞中YAP的去磷酸化和核转位;YAP以TEAD和PPP1CA依赖性的方式在HG条件下转录MIO-M1细胞中的GS;GS促进HG条件下MIO-M1中Gln的生物合成,进而激活mTORC1,而不是mTORC2;MIO-M1细胞在HG条件下的增殖和活化依赖于PPP1CA/YAP/GS/Gln/mTORC1通路;并且PPP1CA/YAP/GS/Gln/mTORC1通路的阻断能够抑制DR过程中RMCs的增殖与活化。结论:RMCs中PPP1CA/YAP/GS/Gln/mTORC1信号通路在HG条件下激活,并促进RMCs的增殖与活化。研究结果进一步揭示了 DR过程中RMCs活化的分子机制,为调控RMCs的活化提供潜在的策略。
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