【摘 要】
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目的:1、本研究采用光标测技术研究窦房组织中的Pnmt+心肌细胞的膜电位（membrane potential,Vm）及细胞内Ca2+瞬变(Ca2+transients,Ca T)特性,旨在阐明Pnmt+心肌细胞的潜在起搏功能。2、明确Pnmt+心肌细胞的电生理特性以及β肾上腺能信号特征。方法:1、左房Pnmt+心肌细胞的潜在起搏功能:本实验在体式显微镜下,按照解剖学方法,分离成年光遗传转基因Pn
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目的:1、本研究采用光标测技术研究窦房组织中的Pnmt+心肌细胞的膜电位（membrane potential,Vm）及细胞内Ca2+瞬变(Ca2+transients,Ca T)特性,旨在阐明Pnmt+心肌细胞的潜在起搏功能。2、明确Pnmt+心肌细胞的电生理特性以及β肾上腺能信号特征。方法:1、左房Pnmt+心肌细胞的潜在起搏功能:本实验在体式显微镜下,按照解剖学方法,分离成年光遗传转基因PnmtCre/Ch R2小鼠的窦房组织（sinoatrial preparation,SAP）。采用电压敏感性荧光染料Di-4-ANBDQPQ和钙敏感性荧光染料Rhod-2 AM进行双染料负载。利用光标测系统同步检测光遗传刺激窦房组织前后,Pnmt+心肌细胞的膜电位及细胞内Ca2+瞬变的特性,探索Pnmt+心肌细胞是否存在潜在的起搏作用。2、β肾上腺能信号特征的研究:本实验采用Langendorff灌流方法急性酶分离获得成年转基因PnmtCre/Ch R2小鼠（12-16周）心肌细胞,利用免疫荧光技术检测Pnmt+心肌细胞的β1、β2肾上腺素受体表达情况。采用可视化边缘探测系统记录不同频率蓝光刺激/电刺激时Pnmt+心肌细胞的收缩与钙信号特征及其与普通心肌细胞的差异;随后分别选择性β1受体激动剂盐酸多巴酚丁胺和选择性β2受体激动剂盐酸妥洛特罗处理,观察激动β肾上腺素受体（β-adrenergic receptors,β-ARs）或选择性激动β1受体、β2受体时Pnmt+心肌细胞的收缩和钙瞬变变化,明确Pnmt+心肌细胞中的β-ARs功能。利用膜片钳技术,记录Pnmt+心肌细胞动作电位,并与普通心肌细胞相比较,观察其电生理特性及与普通心肌细胞的差异。结果:1、采用光标测系统记录到窦性自发的有节律的Ca2+瞬变（由Rhod-2AM标记）,窦房组织的激活点（activation point）位于房间区靠近窦房结的区域。但是,蓝光刺激窦房组织后激活Pnmt+心肌细胞,可诱发心房的Ca2+瞬变激活,传导左移,而在绘制的膜电位电压（membrane protential voltage,Vm）和钙瞬变时程（calcium transient time history,Ca T）图中,以及窦房组织不同区域的电压和钙的踪迹都表明,窦房组织的光遗传起搏可以将激活点向左移动,形成一个新的领先的起搏位点,即neonode。即在蓝光刺激下,含Pnmt+心肌细胞的左房组织可形成新的起搏位点。2、免疫荧光染色方法研究发现Pnmt+心肌细胞表达β1、β2-ARs。3、选择性β1受体激动剂盐酸多巴酚丁胺作用后,Pnmt+心肌细胞的肌小节收缩、钙信号均增强,但增加幅度较普通心肌细胞强;选择性β2受体激动剂盐酸妥洛特罗作用后,Pnmt+心肌细胞的肌小节收缩、钙信号均有增加,肌小节增加幅度与普通心肌细胞相似,但钙信号的增加幅度较普通心肌细胞强。4、Pnmt+心肌细胞与普通心肌细胞的动作电位时程（action potential duration,APD）无明显差异。结论:1、光遗传起搏激活Pnmt+心肌细胞诱发心房产生新的引导起搏位点。2、Pnmt+心肌细胞表达β1、β2-ARs,但两者在Pnmt+心肌细胞中的生理效应与普通心肌细胞不一致,推测Pnmt+心肌细胞在应激状态下发挥重要作用;3、Pnmt+心肌细胞与普通心肌细胞的动作电位（action potential,AP）无显著性差异。
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